Technique de génération de cellules CAR-T spécifiques de l’antigène

Résumé

Source : Davidson, H. W., et al. Génération à haute efficacité de cellules T cytotoxiques primaires de souris spécifiques à l’antigène pour les tests fonctionnels dans un modèle de diabète auto-immun. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo présente une technique permettant de générer des lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) spécifiques de l’antigène par transduction rétrovirale. Des lymphocytes T CD8+ murins activés sont ajoutés à une plaque de micropuits recouverte de fragments de fibronectine recombinante. Des vecteurs rétroviraux contenant de l’ARN transgénique codant pour un récepteur d’antigène chimérique (CAR) spécifique de l’antigène sont ensuite introduits, et la plaque est centrifugée pour faciliter la transduction. Après l’incubation, les cellules transduites expriment à leur surface des CAR spécifiques de l’antigène.

Protocole

1. Génération et validation d’anticorps Fab à chaîne unique (scFab)-CARs.

REMARQUE : Les CARs contiennent généralement 3 domaines critiques : un domaine ciblant l’antigène, un domaine espaceur/transmembranaire et un domaine de signalisation cytoplasmique. La conception précise de chaque CAR dépend de la cible visée, et donc, en dehors des caractéristiques clés de la construction pertinentes pour la génération du rétrovirus, ne sera pas décrite en détail dans ce protocole. La figure 1 illustre la conception générale du RAC utilisé pour les études décrites ci-dessous. En bref, le domaine de ciblage comprend l’ensemble de la chaîne légère et le domaine variable et CH1 de la chaîne lourde de l’anticorps monoclonal parent lié par un linker semi-rigide. Le domaine espaceur/transmembranaire provient de la souris CD28, et le domaine de signalisation est une fusion contenant des éléments de souris CD28, CD137 (4-1BB) et CD247 (CD3ζ). Ces éléments sont assemblés par des procédures standard de biologie moléculaire telles que la réaction en chaîne par polymérase (PCR) par chevauchement d’épissages ou la synthèse d’un « bloc de gènes » approprié. Les détails de la génération du mAB287 CAR sont contenus dans Zhang et al. Les séquences d’ADNc peuvent être obtenues auprès des auteurs sur demande.

1. Assemblage de la construction CAR
   1. Synthétisez séparément l’anticorps Fab à chaîne unique ciblant (scFab) et les domaines d’espacement/signalisation combinés, et utilisez une technique de ligature « en 3 points » pour assembler la construction finale (Figure 1).
      REMARQUE : La principale exigence pour l’insert CAR est qu’il doit contenir des sites endonucléases de restriction flanquants permettant la ligature dans le vecteur d’expression rétroviral pMSCV-IRES-GFP II (pMIG II), ou un dérivé apparenté sont également appropriés.
2. Validation de l’expression de surface du CAR
   1. Transduire les cellules d’hybridome à l’aide de particules rétrovirales dérivées du pMIG II générées par un protocole standard (p. ex., Holst et coll.).
   2. Effectuez une analyse par cytométrie en flux pour détecter l’expression de la GFP à partir du vecteur CAR.
   3. Expression en surface de la coloration du CAR des hybridomes transduits à l’aide d’anticorps marqués contre la chaîne κ de la souris (par exemple, clone RMK-45).
3. Validation de la spécificité CAR
   1. Stimulez les cellules hybridomes transduites avec des antigènes cellulaires ou liés à des plaques appropriés. Après une nuit de co-culture, collecter des surnageants et des cytokines sécrétées, et doser par immuno-enzymatique (ELISA).
      REMARQUE : Idéalement, chaque CAR devrait être validé indépendamment avant d’être utilisé pour la transduction. À cette étape, l’expérience peut être interrompue et redémarrée plus tard.

2. Transfection des cellules productrices virales (jour - 4 à jour 3)

NOTE : Le rétrovirus est produit à l’aide de cellules Phoenix-ECO (voir le tableau des matériaux). Prendre les précautions appropriées pour la production d’agents potentiellement infectieux (de préférence, y compris une armoire désignée de niveau de biosécurité 2 (BSL-2) et un incubateur séparé pour la culture des cellules transfectées/transduites).

1. Décongélation des cellules Phoenix (Jour -4)
   1. Décongeler 2 x 10⁶ cellules Phoenix-Eco. Augmentez le nombre de cellules Phoenix si plusieurs transductions sont prévues.
   2. Placez-les dans une boîte de culture tissulaire de 10 cm avec 10 ml de milieu (milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 10 % de sérum de veau fœtal (SCF)).
2. Passage Cellules du Phénix (Jour -3)
   1. Retirer le milieu et laver avec 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco.
   2. Ajouter 3 mL de trypsine à 0,25 % et incuber à 37 °C sous une atmosphère à 10 % de CO₂ pendant 3 min.
   3. Récoltez les cellules puis granulez par centrifugation pendant 3 min à 200 x g. Replaquez les cellules avec 10 mL de milieu frais et incubez à 37 °C.
3. Irradiation des cellules Phoenix (Jour -1 après-midi)
   1. Pour minimiser la division cellulaire, prélever les cellules Phoenix comme décrit à l’étape 2.2, les remettre en suspension dans 5 mL de milieu et les irradier aux rayons gamma sur de la glace (1000 rad).
      REMARQUE : La prudence doit être utilisée pour les travaux de rayonnement afin d’éviter l’exposition du personnel.
   2. Centrifuger les cellules irradiées, les remettre en suspension dans un milieu frais, déposer une plaque à 2 x 10⁶ cellules (dans 10 mL de milieu)/plaque/CAR, et incuber.
4. Transfection (Jour 0 - matin)
   1. Aspirez le surnageant des cellules Phoenix, lavez-le avec 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et ajoutez soigneusement 7 ml de milieu sérique réduit (par exemple, Opti-MEM) dans le sens de la goutte à goutte sur la paroi latérale de la plaque pour éviter de perturber la monocouche. Transférez les cellules dans l’incubateur.
   2. Prenez deux tubes de polypropylène à fond rond de 14 ml et ajoutez 1,5 ml de sérum réduit à chacun. Dans un tube, ajoutez 40 μL de réactif de transfection (voir le tableau des matériaux).
   3. Dans l’autre tube, ajoutez 15 μg de plasmide Ab-CAR (généré à l’étape 1) et 5 μg de plasmide d’enveloppe et d’emballage (5 μg de pCL-Eco). Incuber les tubes à température ambiante pendant 5 min.
   4. Ajouter le mélange de réactifs de transfection de l’étape 2.4.2 goutte à goutte dans le deuxième tube sans entrer en contact avec les côtés du tube, et mélanger en pipetant doucement la solution de haut en bas 3 fois. Incuber à température ambiante pendant au moins 20 min.
   5. Ajouter 3 ml du mélange goutte à goutte aux cellules Phoenix et placer dans un incubateur de culture tissulaire.
   6. Après 4 à 5 h, ajoutez 1 ml de FCS. Cultiver des cellules pendant une nuit à 37 °C.
5. Changement moyen (jour 1)
   1. Retirer le surnageant contenant les complexes plasmide/réactif de transfection et l’éliminer conformément aux procédures de l’établissement pour la manipulation des matières infectieuses. Ajouter 4 ml de milieu de culture frais et préchauffé dans les cellules.
6. Récolter le virus pour la transduction (jour 2)
   1. Prélevez le milieu contenant le virus dans les cellules Phoenix à l’aide d’une seringue stérile, d’un filtre (0,45 μm) pour éliminer les débris cellulaires résiduels, et collectez-le dans un nouveau tube.
   2. Ajouter un stock d’interleukine-2 humaine recombinante (rhIL-2) à une concentration finale de 200 unités internationales (UI)/mL. Utilisez immédiatement le virus pour la transduction (étape 5.3). Ajouter 4 ml de milieu frais dans les cellules Phoenix et les placer dans l’incubateur.
7. Collecte répétée de virus (jour 3)
   1. Répétez l’étape 2.6, mais jetez les cellules Phoenix comme déchets infectieux au lieu d’ajouter du milieu frais. Ce surnageant est utilisé à l’étape 5.4.

3. Isolement et activation des lymphocytes T CD8 primaires (jour -1 à jour 0)

REMARQUE : Auparavant, préleviez les lymphocytes T CD8 de souris femelles non obèses diabétiques (NOD) à 4 à 5 semaines, un moment avant le début de l’inflammation des îlots. Manipulez toutes les souris en suivant les protocoles approuvés par l’Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC). Les lymphocytes T CD8 sont enrichis à partir de splénocytes à l’aide d’un kit de sélection négative commercial.

1. Plaques d’enrobage d’anticorps CD3/CD28 (Jour -1)
   1. Ajouter 1 mL d’un mélange d’anticorps anti-souris CD3 et CD28 (tous deux à 1 μg/mL dans le PBS) dans chaque puits d’une plaque à 24 puits, et incuber à 4 °C pendant la nuit.
   2. Le lendemain, lavez les plaques avec 1 ml de PBS stérile 3 fois avant d’ajouter les lymphocytes T CD8 murins (étape 4.1).
      REMARQUE : Le nombre de puits à revêtir variera pour chaque expérience, en fonction du nombre total de lymphocytes T CD8 activés nécessaires.
2. Prélèvement de splénocytes (Jour 0)
   1. Euthanasier deux souris femelles NOD âgées de 4 à 5 semaines en utilisant l’inhalation de CO₂ suivie d’une décapitation. Récoltez les rates et placez-les sur une passoire cellulaire en les trempant dans 10 ml de PBS dans une boîte de culture cellulaire sur la glace.
   2. Dans une hotte de culture cellulaire, coupez chaque rate en 3 à 5 morceaux, pressez les tissus avec un piston stérile d’une seringue de 3 ou 5 ml pour séparer les fragments de rate et permettre aux cellules de passer à travers le treillis métallique.
   3. Éliminez doucement les globules rouges en remettant les splénocytes en suspension dans un tampon de lyse des globules rouges dilué 1:4 (1 mL de tampon de lyse dans 3 mL de PBS pour une rate) et en incubant pendant 5 min à température ambiante.
   4. Ensuite, diluer 10 μL de la suspension cellulaire avec une solution de colorant bleu de trypan pour compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, et granuler le reste des cellules par centrifugation à 350 x g pendant 7 min.
3. Enrichissement des lymphocytes T CD8 (jour 0)
   1. Enrichissez les lymphocytes T CD8 par sélection négative à l'aide d'un kit d'isolement des lymphocytes T CD8 de souris, en suivant les instructions du fabricant.
      REMARQUE : Pour garantir une grande pureté, arrondissez toujours le nombre de cellules lors du calcul du volume d’anticorps biotinylés à ajouter (par exemple, utilisez le volume de réactifs suggéré pour 10⁸ cellules pour un calcul de 9,1 x 10⁷ cellules).
   2. Mettre en suspension les pastilles cellulaires dans 400 μL de tampon et 100 μL de cocktail biotine-anticorps par 1 x 10⁸ cellules, bien mélanger et incuber pendant 5 min au réfrigérateur (4 °C) pour permettre la liaison des anticorps.
   3. Ajouter 300 μL de tampon de marquage et 200 μL de microbilles anti-biotine par 1 x 10⁸ cellules, bien mélanger et incuber pendant 10 min à 4 °C.
   4. En attendant la liaison des microbilles, installez la colonne de séparation sur le séparateur. Laver la colonne en rinçant avec 3 mL de tampon d’étiquetage.
   5. Faites passer 1000 μL de mélange billes/cellules à travers une crépine de cellules de 40 μm avant de les charger sur la colonne de séparation pour éliminer les agrégats de cellules. Recueillir le débit de la colonne dans un tube pré-refroidi de 15 mL.
   6. Laver la colonne selon les instructions du fabricant, en recueillant tous les effluents dans le même tube. Déterminer le numéro de cellule (comme à l’étape 3.2.4) et recueillir par centrifugation à 350 x g pendant 5 min. Laver les cellules en les remettant en suspension dans 2 mL de milieu complet pour cellules T (RPMI-1640 contenant du FCS, du 2-mercaptoéthanol, du rhIL-2 (200 U/mL), de l’interleukine-7 de souris (mIL-7, 0,5 ng/mL), de l’ITS, de l’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES) et de la pénicilline-streptomycine) et en centrifugeant à 350 x g pendant 5 min.
   7. Remettre les cellules en suspension dans un milieu de cellules T complet préchauffé (37 °C) à une concentration de 0,25 à 0,5 x 10⁶/mL.

4. Activation des lymphocytes T (Jour 0 à 2)

1. Ajouter 2 mL de suspension cellulaire (0,25 à 0,5 x 10⁶/mL) dans chaque puits enrobé de la plaque à 24 puits enrobée d’anticorps CD3/CD28 de l’étape 3.1.2. Utilisez un mouvement tourbillonnant pour distribuer les cellules uniformément.
   REMARQUE : Ajoutez les cellules à l’aide d’un mouvement tourbillonnant pour les répartir uniformément et minimiser les effets de bord. Si les cellules se regroupent le long du bord des puits, le taux de transduction et la viabilité cellulaire seront diminués.
2. À titre de contrôle, plaquez le même nombre de lymphocytes T CD8 dans un seul puits non revêtu de la plaque. Incuber les cellules à 37 °C à l’aide d’un incubateur gazé à 10 % de_CO2 pendant 48 h
   REMARQUE : Après 48 h, l’activation peut être confirmée à l’aide d’un microscope ; les cellules activées seront plus grandes que les cellules qui n’ont pas rencontré d’anticorps anti-CD3/CD28.

5. Transduction des lymphocytes T CD8 activés (jours 1 à 3)

REMARQUE : Ce protocole utilise une méthode de transduction de spin. Une centrifugeuse dotée d’un rotor pivotant et d’adaptateurs de plaques de culture tissulaire capable de maintenir une température interne de 37 °C est nécessaire. Pour garantir une efficacité maximale, le jour de la transduction, préchauffez la centrifugeuse à 37 °C avant de collecter le virus.

1. Préparation de plaques recouvertes de fragments de fibronectine humaine (Jour 1 à Jour 2)
   1. Le jour 1, ajouter 0,5 mL de fibronectine (50 μg/mL dans du PBS) dans les puits d’une plaque à 24 puits et incuber toute la nuit à 4 °C
      REMARQUE : En règle générale, deux puits enrobés de fibronectine sont nécessaires par plaque de cellules Phoenix transfectées.
   2. Le jour 2, retirer la solution de fibronectine et la remplacer par 1 ml d’albumine sérique bovine (BSA) à 2 % dans du PBS. Incuber à température ambiante pendant 30 min pour « bloquer » les sites de liaison non spécifiques.
   3. Laver les puits traités avec 1 mL de PBS stérile. Après avoir retiré la solution de lavage, la plaque est prête à l’emploi ; ou, peut être scellé et stocké à 4 °C jusqu’à une semaine.
2. Prélèvement de lymphocytes T CD8 activés (jour 2)
   1. Récoltez les lymphocytes T CD8 activés, comptez et calculez la viabilité cellulaire à l’aide du bleu trypan ou d’un instrument automatisé approprié.
   2. Prélever les cellules par centrifugation et les remettre en suspension à 5 x 10⁶ cellules viables/mL pour la transduction. Maintenir une petite aliquote de cellules en culture dans le milieu complet des lymphocytes T dans l’incubateur de CO₂ afin de fournir un contrôle pour le tri cellulaire ultérieur activé par fluorescence des cellules transduites (étape 6).
      REMARQUE : Après une activation de 48 h, le nombre total de cellules doit avoir été multiplié par environ 1,5 et avoir une viabilité supérieure à 95 %.
3. Transduction (Jour 2)
   1. Ajouter 100 μL de suspension de cellules CD8 activées par puits (0,5 x 10⁶ cellules) dans la plaque recouverte de fibronectine. Ajoutez ensuite 1,5 à 2 ml de milieu contenant le virus (de l’étape 2.6) dans chaque puits. Mélangez à l’aide d’un mouvement tourbillonnant pour répartir les cellules uniformément (Figure 2).
   2. Placez la plaque dans un sac en plastique à fermeture éclair et scellez-le (pour assurer un confinement secondaire). Centrifugeuse à 2000 x g pendant 90 min à 37 °C.
   3. Retirez la plaque de la centrifugeuse. Dans le domaine de la sécurité biologique, retirez soigneusement le sac en plastique et assurez-vous que l’extérieur de la plaque n’est contaminé par aucun fluide.
   4. Transférez ensuite la plaque dans l’incubateur dédié à 37 °C de CO₂. Après 4 h, retirer 1 mL du milieu de chaque puits et le remplacer par 1 mL de milieu à cellules T complètes préchauffé. Replacez la plaque dans l’incubateur de CO₂.
      REMARQUE : Manipulez tous les milieux des cellules transduites comme des déchets infectieux.

Résultats

Figure 1 : Schéma de la construction rétrovirale CAR. Le CAR comprend un domaine de ciblage dérivé du fragment Fab d’un anticorps monoclonal de souris approprié, et un domaine d’ancrage membranaire/de signalisation des souris CD28, CD137 et CD247. L’ADNc synthétique est inséré dans le vecteur d’expression rétrovirale pMIG-II. Les sites d’endonucléase de restriction utilisés pour générer le mAb...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2-Mercaptoéthanol (50mM)	Gibco	Référence 21985-023	50 uM
5' PCR DE COURSE	Clontech	634859
anticorps anti-CD28 de souris	eBiosciences	Référence 14-0281-86	Concentration finale à 1μg/ml
anticorps anti-souris CD3e	eBiosciences	145-2C11	Concentration finale à 1μg/ml
Biotine Rat Anti-souris IFN-γ	BD Biosciences	Référence 554410	Concentration de travail à 0,5 μg/ml
Bsa	sigma	A7030
Kit Maxi-Prep sans endo	Qiagen	Référence 12362
gentamicine	Gibco	Référence 15750-060	Finale 50 μg/ml.
FCS inactivé par la chaleur	Hyclone	SH30087.03	Finale 10 % FCS
HEPES (100X)	Gibco	Référence 15630-080	1 fois
Insuline-Transferrine-Sélénium-Éthanolamine (ITS 100x)	ThermoFisher	51500056	La concentration finale est de 1x
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
Colonnes LS	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-042-401
Tampon de séparation MACS	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-091-221
Kit d’isolement des lymphocytes T CD8a+ de souris	Miletenyi Biotec Inc	Tél. : 130-104-075
Kit d’isolement des lymphocytes T CD8a+ de souris	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-104-075
Opti-MEM moyen	ThermoFisher	31985070
Pénicilline-Streptomycine (5000U/ml)	ThermoFisher	15070063	50 U/ml
Cellules Phoenix-ECO	ATCC	CRL-3214
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Gibco	Référence 10010-023
pMIG II	Addgene	Référence 52107
pMSCV-IRES-GFP II	Addgene	Référence 52107
Tampon de lyse des globules rouges	sigma	R7767
RétroNectine	Takara	T100A	Concentration de travail à 50 μg/ml dans le PBS
rhIL-2 (concentration de la matière 105 UI/ul)	Peprotech	Référence 200-02	Concentration finale à 200 UI/ml
rmIL-7 (concentration de stock 50ng/ul)	R&D	407-ML-005	Concentration finale à 0,5ng/ml
Réf. RPMI-1640	Gibco	Référence 11875-093
Crépines à cellules stériles	Fisher Scientific	Tél. : 22-363-548
Tryple	Gibco	Référence 12605-028