1. Micro-injection d’embryons de poisson-zèbre avec des bactéries et un cocktail de phages
REMARQUE : Pour réaliser une infection systémique, l’embryon doit avoir une circulation sanguine qui commence généralement après 26 hpf.
- Après 26 hpf, déchorionner les embryons avec une solution de pronase préparée en dissolvant la poudre de pronase dans un milieu E3 à une concentration de 2 mg/mL. Pipeter doucement les embryons pour briser le chorion. Jetez le milieu pronase/E3 et rincez le plat plusieurs fois avec de l’E3 frais pour éliminer toute la pronase.
- Anesthésier les embryons de poisson-zèbre dans un milieu E3 contenant de la tricaïne environ 5 minutes avant les injections.
- Pipetez les embryons anesthésiés dans la piste préparée à l’étape 1. À l’aide d’un embout de chargement de gel fin, alignez les embryons en position latérale.
- Chargez une aiguille de micro-injection avec environ 5 μL de la préparation de P. aeruginosa.
- Insérez l’aiguille dorsalement jusqu’au point de départ du conduit de Cuvier où elle commence à se répandre sur le sac vitellin. Injectez un volume de 1 à 3 nL et assurez-vous que le volume se dilate directement dans le conduit et entre dans la circulation.
- Environ tous les 50 embryons injectés, injectez une goutte de la bactérie dans un tube à centrifuger de 1,5 mL avec 100 μL de PBS stérile pour vérifier si le volume d’injection reste le même. Appliquer l’inoculum sur de la gélose LB (voir le tableau 1) à 37 °C pendant la nuit pour évaluer l’UFC.
- Transférez les embryons microinjectés dans deux boîtes de Pétri propres avec un milieu E3 frais + PTU (tableau 1) et incuberez-les à 28 °C.
- À deux moments choisis : 30 min ou 3 h après l’injection bactérienne, sortez de l’incubateur l’une des boîtes de Pétri contenant des embryons injectés de bactéries et alignez-les dans la piste comme décrit en 6.3 pour l’injection de cocktail de phages.
- Chargez une aiguille de micro-injection d’environ 5 μL du cocktail de phages (mélange de quatre phages qui infectent la souche PAO1) avec une fine pointe de chargement de gel et fixez-la au micro-injecteur.
- Injecter le cocktail de phages dans le canal de Cuvier des embryons préalablement injectés avec des bactéries.
- Transférez les embryons microinjectés dans deux boîtes de Pétri propres avec un milieu E3 frais + PTU et incuberez-les à 28 °C.
Tableau 1 : Préparation des solutions
| Solutions | préparation |
| Solution mère anesthésique 25X | 4 mg/mL de tricaïne dans du H2O distillé. |
| Solution de travail anesthésique 1X | diluer dans du H2O distillé la solution mère de tricaïne 25X préparation pour atteindre la concentration 1X (0,16 mg/mL) de tricaïne de H2O distillé. |
| CsCl d = 1,3 | 20,49 g dans 50 mL TN |
| CsCl d = 1,4 | 20,28 g dans 50 mL TN |
| CsCl d = 1,5 | 34,13 g dans 50 mL TN |
| CsCl d = 1,6 | 41,2 g dans 50 mL de TN |
| Milieu embryonnaire E3 pour embryon de poisson-zèbre | 1 L 1 d’E3 (diluer le stock 50X avec du H2O distillé) + 200 μl de bleu de méthyle à 0,05 %. Magasin chez RT. |
| Solution mère de milieu embryonnaire E3 (50X) | 73,0 g de NaCl, 3,15 g de KCl, 9,15 g de CaCl2 et 9,95 g de MgSO4 dans 5 L de H2O distillé. Magasin chez RT. |
| Gélose LB | 10 g/L de tryptone, 5 g/L d’extrait de levure, 5 g/L de NaCl, 10 g/L de gélose |
| Bouillon LB | pour 1L : 950 mL d’H2O, 10 g de tryptone, 10 g de NaCl, 5 g d’extrait de levure |
| PBST | PBS 1X + Triton X 1 % |
| Solution physiologique | 0,9 % de NaCl |
| Solution mère bloquant la pigmentation 10X | 0,3 mg/mL de phénylthiourée en poudre (PTU) dans un milieu embryonnaire E3 pour embryon de poisson-zèbre |
| Solution mère de pronase 5X | 5 mg/mL de poudre de pronase dans un milieu embryonnaire E3 pour embryon de poisson-zèbre |
| Tampon TN | 10 mM Tris HCl pH 8,0, 150 mM NaCl |
