Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des animaux
- Utiliser 132 rats Sprague-Dawley mâles de 2 mois pesant de 320 à 450 g (120 rats pour l’expérimentation et 12 rats pour le prélèvement sanguin, figure 1). Quinze rats pour chaque groupe étaient suffisants pour une puissance de 0,8 (80 % de chances de trouver une signification statistique si l’effet spécifié existe).
- Hébergez tous les rats dans des cages classiques dans des conditions d’isolement dans une installation conventionnelle équipée d’une station à langer. Instaurez la reproduction dans un rack IVC (Individual Ventilated Cage), avec des rats SPF (Specific Pathogen-Free) spécifiquement achetés.
- Utilisez les conditions de logement suivantes : plage de température de 19 à 24 °C ; humidité relative : 40 à 60 % ; ventilation : fréquence de renouvellement de l’air : 10 à 15 par h ; cycle lumière/obscurité : 12 h à 12 h.
- Stérilisez tout l’équipement de cage et utilisez de la litière irradiée. Mettre en œuvre systématiquement l’enrichissement des cages en plaçant des plateaux et des serviettes en carton stériles à l’intérieur des cages.
- Permettre l’accès à la zone dans des conditions restreintes : blouse de laboratoire neuve, masque, gants, chaussures et bonnet à l’entrée.
- Effectuer chaque année un suivi de la santé des colonies sur les animaux sentinelles hébergés sur une litière sale, conformément aux recommandations de la Felasa pour les installations conventionnelles. Gardez quatre à cinq animaux par cage avec la ration irradiée appropriée et fournissez de l’eau acidifiée à volonté. Surveillez quotidiennement.
- Transfert des rats choisis pour une intervention chirurgicale dans les cages supérieures filtrantes vers les salles d’opération 2 h avant l’opération.
2. Intervention chirurgicale
- Préparez les instruments chirurgicaux : des ciseaux fins, une pince, deux pinces hémostatiques et un porte-aiguille. Pendant toutes les procédures, portez des gants, un masque, une cagoule et une blouse de laboratoire.
- Divisez au hasard les rats en deux groupes (PRP et solution saline).
- Sortez le rat de sa cage et pesez-le. Utilisez des étiquettes d’oreille numérotées pour identifier les rats. Pour éviter la dessiccation des yeux, placez des gouttes d’eau sur la cornée.
- Anesthésier le rat par voie intrapéritonéale avec de la xylazine (10 mg/kg de poids corporel) et de la kétamine (80 mg/kg de poids corporel). Placez les animaux sous surveillance cardiorespiratoire pour confirmer l’anesthésie et vérifier les réflexes oculaires.
- Injecter 50 μL de buprénorphine par voie sous-cutanée (0,01 à 0,05 mg/kg toutes les 8 à 12 h) dans la région du cou comme analgésique.
- Rasez le membre postérieur gauche avec un rasoir électrique, désinfectez-le avec 3 gommages alternés de solution iso-bétadine/alcool (dilué 1:10) et placez le rat sur un tampon chaud (20 °C) sous un microscope à dissection. Placez le rat sur le décubitus latéral avec la jambe à opérer dans une position supérieure. Tenez la patte avec une pince chirurgicale.
- À l’aide des ciseaux, faites une petite incision latérale (20-25 mm) dans la peau entourant le tendon d’Achille gauche, et disséquez le fascia à l’aide de ciseaux fins pour exposer le complexe du tendon d’Achille (Figure 2a).
- Retirez le tendon plantaire à l’aide de ciseaux (Figure 2b).
- Coupez le tendon d’Achille transversalement à 5 mm de son insertion calcanéenne et retirez une partie de 5 mm de long à l’aide de ciseaux. Ne suturez pas le tendon (Figure 2c, 2d).
- Suturez le fascia et la peau avec un fil résorbable, en faisant une suture par surjet (suture continue). Les sutures monofilaments peuvent également empêcher l’évacuation de la peau vers l’incision chirurgicale.
- Placez le rat sous une lampe chauffante jusqu’à ce qu’il soit réveillé, puis remettez-le dans une cage (58 x 38 cm) (Nota bene : Aucune immobilisation n’est imposée).
3. Préparation du PRP
- Anesthésier les rats donneurs avec de la xylazine (10 mg/kg de poids corporel) et de la kétamine (80 mg/kg de poids corporel) par injection intrapéritonéale. L’injection de PRP est réalisée 2 h postopératoire sans aucun ré-anesthésique.
- Injecter 50 μL de buprénorphine par voie sous-cutanée comme analgésique.
- Prélever du sang total (20 mL par rat, hémorragie finale) par ponction cardiaque dans des tubes stériles contenant du citrate de sodium tamponné à 3,2 % (0,109 M, anticoagulant). Ensuite, euthanasiez le rat par injection intracardiaque.
- Pour obtenir le PRP, centrifugez le sang pendant 10 min à 150 x g et à température ambiante. Cette première étape de centrifugation à basse vitesse donne deux phases distinctes : une phase inférieure composée de globules rouges (GR) qui représente environ 80 à 90 % du volume total et une phase supérieure composée de plasma riche en plaquettes (PRP) (généralement 10 à 20 % de l’échantillon de sang).
- Prélever le PRP (phase supérieure) dans un tube en plastique secondaire à l’aide d’une pipette de transfert en plastique. Comme l’interface entre le PRP et les globules rouges est très lâche, ne pipetez pas trop près de l’interface. Lorsqu’ils sont manipulés correctement, les globules rouges contaminants dans le PRP doivent être inférieurs à 0,05 x 103 cellules/μL. Jetez la phase inférieure restante et le tube de prélèvement sanguin primaire.
- Déterminez le volume de PRP collecté et mesurez le nombre de plaquettes sur un analyseur d’hématologie. Ces valeurs sont nécessaires pour les calculs visant à ajuster la concentration plaquettaire à l’étape suivante. La numération globulaire est également utile pour évaluer la contamination potentielle par les globules rouges et les globules blancs. La concentration plaquettaire dans le PRP à ce stade est généralement de 1 à 1,5 x 106/μL.
- Effectuez une seconde centrifugation du PRP pendant 10 min à 1 000 x g et à température ambiante. Cette étape de centrifugation à grande vitesse produit une pastille de plaquettes lâche et un surnageant de plasma autologue pauvre en plaquettes (PPP). À l’aide des valeurs déterminées à l’étape 3.6, calculer le volume de surnageant à éliminer pour concentrer le PRP et atteindre une concentration finale de 2,5 x106/μL.
- Prélever délicatement le surnageant (PPP) dans un tube en plastique secondaire à l’aide d’une pipette de transfert en plastique, en laissant environ les deux tiers du volume final calculé à l’étape 3.7. Comme la pastille est lâche, une quantité importante de plaquettes est perdue lorsque le PPP est jeté, ce qui peut réduire la concentration souhaitée.
- Remettez soigneusement en suspension la pastille plaquettaire avec le surnageant restant par pipetage doux et répété. Mesurez la numération plaquettaire sur ce PRP concentré. Si nécessaire, ajoutez le volume approprié de PPP autologue pour atteindre la concentration cible finale.
note: Utilisez le PRP dans les 3 h suivant la préparation.
- Ajouter 50 μL de CaCl 2 (11 mEq10 mL) par mL de PRP pour activer les plaquettes.
- Injecter 50 μL de PRP frais ou de solution saline avec une aiguille 21G directement dans le site d’opération suturé environ 1 h après la préparation. Pendant ce temps, conservez le PRP à température ambiante.
- Surveillez de près la récupération fonctionnelle des rats pendant les jours qui suivent l’opération et avant l’ablation du tendon d’Achille.
