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1. Synthèse de polymères poly(bêta-aminoesters) (pBAE) avec des oligopeptides finaux (OM-pBAE)
- Polymérisation du C6-pBAE
- Ajouter du 5-amino-1-pentanol (38 mmol ; MW = 103,16 Da) 1-hexylamine (38 mmol ; MW = 101,19 Da) dans une fiole en verre à fond rond (100 mL). Ensuite, ajoutez du diacrylate de 1,4-butanediol (82 mmol ; MW = 198,22 Da).
- Préchauffez le bain d’huile de silicone à 90 °C, placez le ballon à fond rond dans le bain d’huile et mélangez le mélange à l’aide d’un barreau magnétique pendant une nuit (~18 h). Ensuite, sortez le produit de la fiole à fond rond et placez-le au congélateur à -20 °C.
note: Le produit se présente sous la forme d’une poudre collante et est sorti de la fiole à l’aide d’une spatule. Il est essentiel de valider la structure du polymère obtenu par RMN 1H. Les spectres RMN ont été enregistrés dans un instrument de 400 MHz (voir Tableau des matériaux) en utilisant le chloroforme-d et le D2O comme solvants. Environ 10 mg de chaque poly(β-amino ester) ont été prélevés et dissous dans 1 mL de solvant deutéré.
- Réaction avec des peptides pour obtenir OM-pBAE
- Ajoutez 25 ml de HCl 0,1 M aux peptides sélectionnés, par exemple le peptide Cys-His-His-His avec de l’acide trifluoroacétique (TFA, 200 mg), dans un tube à centrifuger de 50 ml préalablement pesé qui peut résister à la lyophilisation et à remuer manuellement pendant la nuit pour obtenir une solution claire.
- Congelez la solution à -80 °C pendant 1 h et lyophilisez le chlorhydrate peptidique obtenu.
REMARQUE : Vérifiez si le poids final correspond à la valeur théorique.
- Préparez une solution de C6-pBAE (0,031 mmol) dans du sulfoxyde de diméthyle. Préparez également une solution de chlorhydrate peptidique (0,078 mmol) dans du sulfoxyde de diméthyle.
- Mélangez les deux solutions dans un tube à bouchon à vis et vissez le bouchon. Mélangez la solution dans un bain-marie à une température contrôlée de 25 °C pendant 20 h à l’aide d’une barre d’agitation magnétique.
- Ajouter le mélange à de l’éther diéthylique/acétone 7:3 (v/v). Centrifuger la suspension résultante à 25 000 x g à 4 °C pour éliminer le solvant. Ensuite, lavez le solide avec de l’éther diéthylique/acétone 7:3 (v/v) deux fois. Ensuite, séchez le produit sous vide (<0,2 atm).
- Faire une solution de 100 mg/mL du produit dans du sulfoxyde de diméthyle. Le produit résultant est nommé C6-peptide-pBAE. Il est essentiel de valider la structure du polymère obtenu par RMN 1H pour confirmer la disparition des signaux oléfines associés aux acrylates terminaux. S’il n’est pas utilisé, le polymère peut être congelé à -20 °C.
2. Formation des polyplexes
REMARQUE : Toutes les procédures doivent être effectuées à l’intérieur d’une pièce climatisée pour maintenir une température constante.
- Décongelez les polymères C6-peptide-pBAE et vortex la solution.
- Pipeter le polymère de haut en bas et préparer une solution de 12,5 mM (V1) dans de l’acétate de sodium (NaAc). Ensuite, agitez le mélange et attendez 10 min.
- Préparez l’acide ribonucléique messager (ARNm) à 0,5 mg/mL et mélangez par pipetage (V2).
note: Il est crucial d’éviter le vortex de l’ARNm.
- Vortex le mélange de polymères à la concentration finale pour obtenir une solution homogène entre le stock de polymères dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) et le tampon d’acétate.
note: La concentration finale du polymère dépend du rapport N/P (groupes azote/phosphate) sélectionné. Le rapport N/P dépend de chaque ARNm spécifique à utiliser. Pour l’encapsulation améliorée de la protéine fluorescente verte (eGFP), par exemple, un rapport de 25:1 a été utilisé, comme indiqué précédemment.
- Mélanger la solution de matériel génétique et la solution de C6-peptidepBAE (25x de la concentration d’ARNm) dans un rapport de 1:1 (Vi = V1 + V2).
note: Le peptide-pBAE en C6 est chargé dans un tube de microcentrifugation où l’ARNm est ajouté par pipetage de haut en bas pour le mélange. Une fois préparés, les concentrations de polyplexe, d’acide nucléique et de C6-peptide-pBAE sont à moitié diluées.
- Incuber à 25 °C pendant 30 min dans un bloc thermique. Précipiter avec de l’eau exempte de RNase 1:2 en ajoutant l’échantillon dans un tube de microcentrifugation préchargé avec de l’eau.
- Incluez les excipients. Ajouter le même volume que le mélange d’ARNm et de pBAE (Vi) dans l’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES) 20 mM et le saccharose 4 % en pipetant de haut en bas. À ce stade, l’échantillon a été dilué 3x.
3. Lyophilisation des polyplexes
- Congeler instantanément à -80 °C la solution polyplexe précédente pendant 1 h.
- Effectuez le séchage primaire en suivant les étapes suivantes : (1) 1 h à -60 °C et 0,001 hPa ; (2) 1 h à -40 °C et 0,0001 hPa ; (3) 4 h à -20 °C et 0,0001 hPa ; (4) 12 h à 5 °C et 0,0001 hPa.
- Conserver immédiatement à -20 °C pour éviter la réhydratation jusqu’à l’utilisation.