1. Expression du noyau de nanoparticules de protéines auto-assemblées contenant un faisceau à six hélices (SHB-SAPN) protéine chez E. coli BL21(DE3)
- Mélanger 95 mL du composant A et 5 mL du composant B du milieu dans un erlenmeyer en verre stérile de 2 L selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matières). Ajouter de l’ampicilline à une concentration finale de 100 μg/mL.
- Inoculer le milieu avec E. coli à partir d’une culture mère de glycérol préalablement établie. Incubation de la culture à 30 °C avec agitation à 200 rotations par minute (tr/min) pendant 48 h
REMARQUE : Le stock d’E. coli BL21 (DE3) utilisé contenait le vecteur d’expression résistant à l’ampicilline avec le gène SHB-SAPN. Bien que le protocole général du milieu recommande 24 h d’incubation à 37 °C, 48 h d’incubation à 30 °C donnent un rendement plus élevé pour le SHB-SAPN.
- Transférez la culture dans deux tubes coniques de 50 ml. Centrifugez les tubes à 4 000 x g pendant 10 min à l’aide d’un rotor à angle fixe à 4 °C. Retirez le surnageant et conservez la pastille pour récolter les cellules.
REMARQUE : Le granulé de cellule peut être soit traité immédiatement, soit congelé à -80 °C jusqu’à son utilisation.
2. Lyse d’E. coli BL21(DE3) par sonication
REMARQUE : Utilisez des objets en plastique et en verre apyrogènes cuits à 250 °C pendant au moins 30 min. La tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP), en tant qu’agent réducteur, rompt les liaisons disulfure à l’intérieur et entre les protéines. Le TCEP est nécessaire pour les tampons au cours de ce protocole si l’antigène affiché contient des liaisons S-S. Pour le noyau SHB-SAPN uniquement, la présence de TCEP dans les tampons n’est pas essentielle.
- Préparez un tampon sans imidazole (8 M d’urée, 50 mM de phosphate de sodium monobasique, 20 mM de base Tris, 5 mM de TCEP) pH 8,0 (ajusté avec 5 N d’hydroxyde de sodium, NaOH) et filtrez-le à l’aide d’une unité de filtration de bouteille sous vide de 0,22 μm.
- Remettre en suspension les cellules granulées (à partir de l’étape 1.3) avec 40 mL de tampon sans imidazole dans un tube conique de 50 mL. Soniquer les cellules remises en suspension avec une sonde sur glace pendant 5 min (4 s de sonication, 6 s de repos) avec une sortie de sonication de 150 W.
- Centrifuger le lysat cellulaire (40 mL) à 29 000 x g à 4 °C pendant 25 min dans un rotor à angle fixe pour générer un surnageant clarifié. Transvaser le surnageant dans une fiole stérile de 150 mL et jeter la pastille. Diluer le surnageant à 100 mL à l’aide du tampon exempt d’imidazole (ci-après dénommé « échantillon » dans le protocole).
REMARQUE : Cette étape de dilution est nécessaire pour éviter que la pression du système de chromatographie liquide à haute performance (FPLC) ne devienne trop élevée lors de la charge de lysat sur la colonne.
3. Purification des protéines à l’aide d’une colonne His-
REMARQUE : Ce protocole a été réalisé à l’aide d’un instrument FPLC, mais il peut être adapté à l’écoulement gravitaire.
- Préparez les tampons suivants et filtrez-les à l’aide d’une unité de filtration de bouteille sous vide de 0,22 μm : (i) tampon sans imidazole « tampon A » (8 M d’urée, 50 mM de phosphate de sodium monobasique, 20 mM de base Tris, 5 mM de TCEP) pH 8,0 ; (ii) 500 mM de tampon imidazole « tampon B » (8 M d’urée, 50 mM de phosphate de sodium monobasique, 20 mM de base Tris, 5 mM de TCEP, 500 mM d’imidazole) pH 8,0 ; et (iii) lavage à l’isopropanol (20 mM Tris, 60 % d’isopropanol) pH 8,0.
REMARQUE : Le pH de chaque tampon a été ajusté avec 5 N de NaOH.
- Équilibrer la colonne_his.
REMARQUE : Pour la production à l’échelle du laboratoire, ce protocole utilise une colonne HiS préemballée de 5 ml, mais n’importe quelle colonne de plus grande taille peut être utilisée.
- Ouvrez le logiciel FPLC et cliquez sur l’option Nouvelle méthode. Il s’ouvrira immédiatement dans le menu des paramètres de la méthode. Dans le menu déroulant de la position de la colonne, choisissez C1 port 3.
- Dans le menu déroulant Montré par la technique, choisissez affinité. Dans le menu déroulant Type de colonne, choisissez autres, Histrap HP, 5 mL. Le volume de la colonne et les boîtes de pression seront automatiquement réglés sur les valeurs appropriées.
- Cliquez sur le bouton Schéma de la méthode. Faites glisser les boutons suivants à partir du menu contextuel de la bibliothèque de phases : équilibration, application d’échantillon, lavage de colonne et élution à côté de la flèche dans cet ordre exact. Fermez le menu de la bibliothèque de phases.
- Cliquez sur le bouton d’équilibration. Les valeurs répertoriées dans le tableau doivent être « tampon initial B » (4 %), « tampon final B » (4 %) et « volume (CV) » 5.
- Cliquez sur la case Exemple d’application. Dans la boîte de chargement de l’échantillon, cliquez sur la case d’option Injecter l’échantillon sur la colonne avec la pompe d’échantillonnage. Assurez-vous que la case à côté des paramètres Utiliser le débit de la méthode est cochée dans la case d’injection d’échantillon avec pompe système. À côté de la zone de volume sur le côté droit de l’écran, modifiez la valeur à 20 ml.
- Cliquez sur le bouton Lavage de colonne. Les valeurs répertoriées dans le tableau doivent être « tampon initial B » (4 %), « tampon final B » (4 %) et « volume (CV) » 5. À côté du schéma de collecte des fractions, décochez la case Activer.
- Cliquez sur le bouton d’élution. Les valeurs répertoriées dans le tableau doivent être « tampon initial B » 0 %, « tampon final B » 100 % et « volume (CV) » 5. À côté du schéma de collecte des fractions, cliquez sur la case Activer. Décochez l’option Utiliser la fraction des paramètres de la méthode et ajustez la fraction à 4 ml dans la case à remplir ci-dessous.
- Cliquez sur le bouton Enregistrer sous en haut du logiciel. Nommez le fichier « equilibration ».
- Connectez une colonne HIS préemballée de 5 ml au port de colonne 3 correspondant sur le FPLC. Les tubes des pompes A et B, ainsi que ceux de la pompe d’échantillonnage, doivent être placés dans de l’eau désionisée filtrée de 0,22 μm. Exécutez le programme d’équilibration.
- Placez la pompe A et la pompe B, ainsi que le tube de la pompe d’échantillonnage, dans le tampon sans imidazole (tampon A) et exécutez à nouveau le protocole d’équilibration.
- Liez l’échantillon à la colonne et purifiez la protéine.
- Ouvrez le logiciel FPLC et cliquez sur l’option Nouvelle méthode. Il s’ouvrira immédiatement dans le menu des paramètres de la méthode. Dans le menu déroulant Colonne, positionnez, choisissez C1 port 3. Dans le menu déroulant Montré par la technique, choisissez affinité. Dans le menu déroulant du type de colonne, choisissez autres, Histrap HP, 5 mL. Le volume de la colonne et les boîtes de pression seront automatiquement réglés sur les valeurs appropriées.
- Cliquez sur le bouton Schéma de la méthode. Faites glisser les boutons du menu contextuel de la bibliothèque de phases : équilibration, application de l’échantillon, lavage de colonne (lavage 1), lavage de colonne (lavage 2), lavage de colonne (lavage 3) et élution à côté de la flèche dans cet ordre exact. Fermez le menu de la bibliothèque de phases.
- Cliquez sur le bouton Equilibration. Les valeurs indiquées dans le tableau doivent être « tampon initial B » 4 %, « tampon final B » 4 % et « volume (CV) » 5.
- Cliquez sur la case Exemple d’application. Dans la boîte de chargement de l’échantillon, cliquez sur la case d’option pourl’échantillon I nject sur la colonne avec la pompe d’échantillonnage. Assurez-vous que la case à côté des paramètres Utiliser le débit de la méthode est cochée dans la case d’injection d’échantillon avec la pompe du système.
- À côté de la zone de volume sur le côté droit de l’écran, définissez la valeur sur 100 ml. À côté du schéma de collecte des fractions, cliquez sur le bouton Activer. Décochez l’option Utiliser la taille de fraction dans la zone Paramètres de méthode, puis remplacez la taille de la fraction par 4 ml.
- Cliquez sur le bouton de lavage de la première colonne (Lavage 1). Les valeurs répertoriées dans le tableau doivent être « tampon initial B » 4 %, « tampon final B » 4 % et « volume (CV) » 10. À côté du schéma de collecte des fractions, cliquez sur la case Activer. Décochez l’option Utiliser la taille de fraction dans les paramètres de la méthode, puis remplacez la taille de la fraction par 4 ml.
- Cliquez sur le bouton de lavage de la deuxième colonne (Lavage 2). Les valeurs répertoriées dans le tableau doivent être « tampon initial B » 0 %, « tampon final B » 0 % et « volume (CV) » 5. À côté du schéma de collecte des fractions, cliquez sur la case Activer. Décochez l’option Utiliser la taille de fraction dans les paramètres de la méthode, puis remplacez la taille de la fraction par 4 ml.
- Cliquez sur le bouton de lavage de la troisième colonne (Lavage 3). Les valeurs répertoriées dans le tableau doivent être « tampon initial B » 0 %, « tampon final B » 0 % et « volume (CV) » 5. À côté du schéma de collecte des fractions, cliquez sur Activer. Décochez l’option Utiliser la taille de fraction dans la zone Paramètres de méthode, puis remplacez la taille de la fraction par 4 ml.
- Cliquez sur le bouton Elution. Dans la table de droite, cliquez sur les informations répertoriées et, dans le menu qui s’affiche, cliquez sur l’étape Supprimer. Faites glisser deux fois le bouton de dégradé isocratique sur la table pour qu’il y ait deux entrées.
- La valeur de la première entrée doit être « tampon initial B » 30 %, « tampon final B » 30 % et « Volume (CV) » 10. La valeur de la deuxième entrée doit être « tampon initial B » 100 %, « tampon final B » 100 % et « volume (CV) » 10. À côté du schéma de collecte des fractions, cliquez sur le bouton Activer. Cochez la case à côté de Utiliser la taille de fraction dans les paramètres de la méthode.
- Cliquez sur le bouton Enregistrer en haut du logiciel. Nommez le fichier « purification ». Le tube de la pompe A du FPLC doit être placé dans le tampon de lavage sans imidazole, tandis que le tube de la pompe B doit être placé dans le tampon d’imidazole de 500 mM. Le tube de la pompe d’échantillonnage doit être inséré dans l’échantillon de 100 ml.
- Exécutez le programme de « purification » et attendez le moment où l’isopropanol à 60 % est nécessaire (lavage 2). Mettre le programme en pause ; déplacer la pompe Un tube du lavage sans imidazole dans le lavage à l’isopropanol à 60 %. Redémarrez le programme.
- Une fois l’étape de l’isopropanol terminée, mettez à nouveau le programme en pause et passez au pompage du tube A dans le tampon de lavage sans imidazole. Redémarrez le programme de purification (le reste du cycle est automatisé).
