Construire un modèle de souris humanisé avec une immunité artificielle contre le VIH

Abstract

Source : Zhen, A., et al. Immunité artificielle à base de cellules souches contre l’infection par le VIH dans le modèle murin humanisé. J. Vis. Exp. (2016).

La vidéo présente une technique permettant de générer un modèle de souris humanisée avec une immunité artificielle à base de cellules souches contre le virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Du tissu thymus fœtal humain et des cellules souches hématopoïétiques (CSH) modifiées sont implantés dans la capsule rénale d’une souris gravement immunodéprimée. Les CSH, qui expriment des récepteurs antigéniques chimériques (CAR) contre le VIH, sont mélangées dans un mélange de protéines gélatineuses qui favorise leur co-localisation avec le tissu du thymus. Après l’intervention, les CSH se différencient en diverses cellules immunitaires humaines, ce qui a entraîné le développement d’un modèle de souris humanisé doté d’un système immunitaire humain fonctionnel contre le VIH.

Protocol

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut. Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Construction de souris humanisées conçues avec un récepteur antigénique chimérique CD4

1. Traitement du thymus fœtal et isolement des CSH CD34+ du foie fœtal
   1. Traitement du thymus
      1. Lavez délicatement le thymus dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4, dans un tube conique de 15 ml. Répétez l’étape de lavage 3 à 4 fois.
      2. Ajouter 7 ml de milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) + 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) + pénicilline/streptomycine (Pen/streptomycine). Décantez le tout dans une boîte de Pétri stérile de 100 mm.
      3. À l’aide de scalpels, coupez le thymus en petits morceaux d’environ 1^mm2. Placez chaque morceau de thymus dans un seul puits sur une assiette de 96 puits. Utilisez une pince émoussée incurvée pour transférer des morceaux de thymus dans la plaque à 96 puits.
         1. Ajoutez une petite quantité de milieu (100 à 200 μl) dans tous les puits afin que le tissu ne sèche pas. Visualisez au microscope (les thymi ont des lobes et doivent ressembler à des sacs de cellules).
            note: Jetez toutes les pièces qui semblent douteuses de quelque manière que ce soit ; Il y a souvent du tissu conjonctif, et celui-ci ne doit pas être implanté.
      4. Retirez les morceaux de thymus confirmés et placez-les tous dans une fiole de culture cellulaire T25. Ajouter 7 ml de milieu RPMI complété par 10 % de FBS et 450 μg/ml de pipéracilline/tazobactam et d’amphotéricine B. Secouer doucement la fiole pour mélanger. Cultiver le ballon pendant la nuit à 37 ºC/5 % CO₂.
         note: Cette étape est nécessaire pour éviter la contamination bactérienne des tissus.
      5. (Étape facultative) Congelez le thymus pour une utilisation future. Équilibrez les morceaux dans du sérum AB humain à 90 % avec du diméthylsulfoxyde à 10 % (DMSO) pendant 10 min. Congelez-les à 1 ºC/min à -50 ºC, puis refroidissez-les rapidement à -150 ºC. Une fois prêt à décongeler, décongeler rapidement dans un bain-marie à 37 ºC et laver doucement 3 fois dans un média complet RPMI sans DMSO.
   2. Traitement du foie
      1. Lavez doucement le foie dans du PBS dans un tube conique de 50 ml. Répétez l’étape de lavage 3 à 4 fois.
      2. Ajoutez 10 ml de média modifié Dulbecco (IMDM) d'Iscove dans le tube conique de 50 ml. Décantez le tout dans une boîte de Pétri stérile de 100 mm.
      3. Homogénéiser le tissu hépatique à l’aide de deux scalpels. Coupez le foie en petits morceaux d’environ 3 mm². Découpez et jetez tout tissu conjonctif blanc.
      4. À l’aide d’une seringue de 10 ml munie d’une aiguille émoussée de calibre 16, prélever les morceaux de foie et le milieu. Ensuite, transférez dans un tube conique de 50 ml.
      5. Remettez en suspension le milieu et la suspension tissulaire et expulsez 5 à 7 fois de plus pour homogénéiser complètement le tissu.
      6. Préparez un média IMDM de 10 ml complété par des enzymes : 500 U/ml de collagénase, 2 400 U/ml d’hyaluronidase et 300 U/ml de DNase ainsi que 450 μg/ml de pipéracilline/tazobactam et d’amphotéricine B. Filtrez le média à l’aide d’un filtre de 0,22 μm, puis ajoutez le média à la suspension hépatique.
      7. Boucher le tube conique de 50 ml contenant la suspension hépatique et le fermer hermétiquement avec un film auto-obturant tel que Parafilm pour éviter les fuites. Tourner dans un rotateur de tube dans l’incubateur à 37 ºC pendant 90 min.
      8. Filtrez la suspension cellulaire digérée à travers une passoire cellulaire de 100 μm dans un tube frais de 50 ml.
         note: Ajoutez du PBS à la suspension pour augmenter le volume total à 50 ml. Divisez-le en deux tubes de 50 ml, contenant chacun 25 ml de suspension cellulaire.
      9. Sous-couche lentement et doucement les cellules de chaque tube avec un milieu de centrifugation d’une densité de 10 ml (par exemple, Ficoll). Essorage à 1 200 x g pendant 20 min sans frein. Remarque : toutes les centrifugations mentionnées dans ce protocole se font à température ambiante (25 ºC).
      10. Retirez délicatement l’interface (c’est-à-dire la couche leucocytaire) de chaque tube et transférez-le dans deux tubes séparés de 50 ml. Porter le volume de chaque tube d’interface jusqu’à 50 ml avec du PBS. Essorage à 300 x g pendant 7 à 10 min. Aspirez le surnageant avec précaution.
      11. Mélangez les deux granulés. Laver trois fois de plus avec 50 ml de PBS contenant 2 % de FBS. Faites tourner à 300 x g pendant 7 à 10 minutes chacun en aspirant soigneusement le surnageant.
      12. Remettre la pastille en suspension dans un média RPMI de 50 ml + 10 % de FBS. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre avant de procéder au tri cellulaire.
      13. Selon le protocole du fabricant, triez immédiatement les cellules CD34+ à l'aide d'un kit de tri CD34 (par exemple, des microbilles CD34).
          note: Alternativement, les cellules peuvent être cultivées pendant la nuit dans un milieu RPMI + 10 % FBS à 1 million/ml.
      14. Enregistrez les fractions CD34+ et CD34-.
          note: À cette étape, les cellules CD34+ et CD34- peuvent être congelées à l’aide d’un produit de congélation Bambanker ou d’un autre support de congélation. Congelez 1 ml de 4 à 6 x 10⁶ cellules CD34+ par tube et congelez 1 ml de 40 à 60 x 10⁶ cellules CD34- par tube.
2. Transduction des cellules CD34+
   1. Calculez le nombre de puits de transduction requis pour une plaque de culture tissulaire à 6 puits. Un puits peut être utilisé pour transduire jusqu’à 8 x 10⁶ cellules. Pour chaque souris BLT, 0,5 x 10^cellules CD34+ 6 seront implantées avec des cellules CD34- et du thymus sous la capsule rénale, et 0,5 x 10^cellules CD34+ 6 seront injectées par voie intraveineuse. Le nombre de cellules CD34+ à utiliser est déterminé par le nombre de souris (1 million de cellules par souris).
   2. Enduire le nombre nécessaire de puits de plaque à 6 puits non traités par culture tissulaire avec 1,25 ml de solution de fibronectine humaine recombinante (par exemple, Retronectin) (20 μg/ml dans PBS) dans chaque puits. Couvrez la plaque et laissez-la reposer pendant 2 heures à température ambiante dans une enceinte de biosécurité propre.
   3. Aspirez la solution de fibronectine des puits et ajoutez 1,25 ml de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) (PBS avec 4 % FBS) dans chaque puits pour le blocage. Laisser reposer la plaque à température ambiante (25 ºC) pendant 30 min.
   4. Aspirez le tampon FACS et lavez les puits une fois avec PBS.
   5. Conservez le PBS dans les puits enduits jusqu’à ce que la plaque soit prête à l’emploi. Conservez l’assiette à 4 ºC pendant la nuit si elle n’est pas utilisée immédiatement.
   6. Plaquez les cellules CD34+ dans un milieu infectieux (2 % d'albumine sérique humaine dans le milieu de cellules T sans sérum d'Yssel) dans des puits recouverts d'une solution de fibronectine (~2 x 10⁶ cellules/ml) et incubez à 37 ºC pendant 1 h.
   7. À l’aide d’une pipette, ajouter des vecteurs lentiviraux dans les puits à une multiplicité d’infection (MOI) comprise entre 2 et 10. Mélanger doucement et incuber toute la nuit à 37 ºC.
      note: Le titre du vecteur lentiviral utilisé doit être déterminé au préalable.
   8. Récoltez les cellules le lendemain en raclant doucement le fond des puits à l’aide d’un grattoir cellulaire. Prélever des cellules et compter à l’aide d’un hémocytomètre.
   9. Pour préparer les cellules à l’implant, combinez 0,5 x 10⁶ cellules CD34+ transduites avec 4,5 x 10⁶ cellules CD34- par souris, en aliquote dans des tubes stériles à bouchon à vis de 1,5 ml. Faites tourner les cellules à 300 x g jusqu’à la pastille et aspirez le surnageant. Faites-les tourner à nouveau à 300 x g, aspirez tout surnageant restant à l’aide d’une pipette P10 et aspirez très soigneusement. Gardez les granulés secs sur de la glace tout au long de l’étude. note: Pour vous assurer que les cellules sont viables, utilisez les cellules granulées et effectuez la chirurgie dans les 2-3 heures.
   10. Pour préparer les cellules à l’injection, faites tourner 0,5 x 10⁶ cellules CD34+ transduites par souris pour granuler et aspirer le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans un support RPMI de 100 μl par souris et conservez-les sur la glace.
   11. Pour vérifier l’efficacité de la transduction, aliquote ~1 x 10⁵ cellules CD34+ non transduites et transduites de chaque condition et culture dans un milieu de cytokines de 200 μl (milieu RPMI avec 10 % de FBS, complété par 100 ng/ml d’IL-3, IL-6, SCF humaines) dans une plaque de 96 puits pendant 5 à 7 jours à 37 ºC.
       note: Les cellules utilisées dans cette étape ne sont pas utilisées pour la chirurgie, mais pour s’assurer que la transduction est réussie et que le vecteur n’est pas toxique pour la survie et le renouvellement des cellules souches. L’efficacité de la transduction peut être vérifiée en recherchant l’expression génique du vecteur (par exemple, GFP et CD4) et analysée par cytométrie en flux.
3. Greffes de tissus pour construire des souris génétiquement modifiées
   1. Le même jour avant la chirurgie, une irradiation corporelle totale du NOD est effectuée. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) souris immunodéprimées avec un irradiateur au césium-137 et un dosage de 2,7 Gy (270Rad).
      note: Les souris NSG sont sévèrement immunodéprimées. Par conséquent, leur logement et leur entretien doivent être conformes aux normes sanitaires les plus élevées et être pris en charge par un personnel hautement qualifié.
   2. Versez les morceaux de thymus et le milieu de la fiole dans un plat de 60 mm. Versez le PBS dans un autre plat de 60 mm, qui sera utilisé pour nettoyer le trochar et garder le rein humide.
   3. Réfrigérez les pointes de pipette à déplacement positif en les plaçant dans des tubes à vis stériles ouverts de 1,5 ml sur de la glace. Conservez sur de la glace avec les granulés de cellules séchées et le mélange de protéines gélatineuses tel que Matrigel.
      note: Il est important de garder le mélange de protéines gélatineuses et tous les tubes ou embouts qui le toucheront froids jusqu’à ce que l’aiguille de l’implant soit chargée.
   4. Anesthésiez les souris : pesez les souris individuellement et notez les poids ; frappez les souris pour les numéroter. Injectez-leur par voie intrapéritonéale 15 μl de kétamine (2,6 mg/ml dans une solution saline)/xylazine (100 mg/ml dans une solution saline) par gramme de poids corporel. Remettez les souris dans la cage et attendez qu’elles soient complètement anesthésiées.
      note: Vérifiez le niveau d’anesthésie de la souris en serrant une patte. Si la souris tressaille par réflexe, administrez 25 à 50 % de la quantité initiale de kétamine/xylazine pour anesthésier davantage la souris. Attendez qu’il ne bronche pas par réflexe pour effectuer la chirurgie.
   5. À l’aide de la tondeuse Oster (rasoir), rasez le côté gauche de chaque souris de la hanche à l’épaule entre le centre du dos et le ventre. Injecter par voie sous-cutanée 0,3 ml de carprofène dilué (6 mg/kg) dans l'épaule ou le triangle inguinal (fosse de la patte) de l'animal. À l’aide d’un coton-tige, mettez une petite goutte de larmes artificielles sur chaque œil et posez la souris sur le côté dans la cage.
      note: Limitez la préparation à la chirurgie à une cage (environ 4 à 5 souris) à la fois.
   6. Rincer la canule de l’aiguille de l’implant cancéreux de calibre 16 (trocart) avec du PBS. À l’aide d’une paire de pinces incurvées émoussées, placez un morceau de thymus de la boîte de 60 mm dans l’ouverture de la canule avec le trocart juste à l’intérieur de l’ouverture, puis tirez sur le trocart pour aspirer le tissu dans la canule.
   7. À l’aide d’une pipette à déplacement positif et d’une pointe réfrigérée, placez 5 μl de protéines gélatineuses froides dans le tube avec une pastille de cellules séchées (mélange CD34+ et CD34- pour les cellules implantées) et remuez doucement pour générer une suspension cellulaire. Ne pipetez pas de haut en bas. Pipeter le mélange de protéines gélatineuses / suspension cellulaire dans l’ouverture de la canule et tirer lentement sur le trocart pour charger l’aiguille.
      note: Il est recommandé d’avoir un assistant pour charger la pipette pendant que l’on manipule l’aiguille de l’implant.
   8. Tamponnez la zone rasée de la souris avec de la povidone iodée, puis essuyez la zone avec une lingette imbibée d’alcool trois fois. Déterminez la tache la plus foncée sous la peau. Cela indique l’emplacement de la rate. Le rein est d’environ 5 mm dorsal par rapport à la rate. Soulevez la peau à l’aide d’une pince incurvée et faites une incision de 15 mm de long avec des ciseaux chirurgicaux dans la peau parallèlement à la rate. Ensuite, faites une coupe similaire dans la couche de péritoine ci-dessous. Chez les mâles, le rein doit être facilement visible et peut être extrudé simplement en appuyant sur l’abdomen. Vous pouvez soutenir le rein avec un hémostatique ou une pince émoussée incurvée. Chez les femelles, les ovaires ont tendance à bloquer le rein pour faciliter l’extraction. À l’aide d’un hémostat, prélevez l’ovaire et exposez soigneusement le rein.
   9. À l’aide de la pince à pointe d’aiguille, vous percevez un petit trou à l’extrémité postérieure de la capsule rénale.
      note: N’utilisez pas ces pinces à pointe d’aiguille pour manipuler des matériaux à risque biologique.
   10. Glissez l’aiguille de l’implant dans ce trou et le long du rein jusqu’à ce que l’ouverture de la canule soit complètement recouverte par la capsule rénale.
   11. Extrudez doucement le tissu sous la capsule rénale et tirez l’aiguille vers l’extérieur. Les morceaux de thymus peuvent être collants, alors utilisez des pinces incurvées pour vous assurer que le morceau de thymus ne sort pas avec l’aiguille.
   12. Soulevez le péritoine à l’aide de la pince et utilisez doucement l’hémostat pour remettre le rein en place. Faites un point à double nœud dans le péritoine à l’aide de sutures résorbables en vicryl 4-0. Utilisez deux clips d’enroulement Autoclips pour fermer la peau.
   13. Mélangez les cellules CD34+ transduites mises de côté pour l’injection et absorbez 100 μl (0,5 x 10⁶ cellules) dans une seringue à insuline. Injectez ces cellules dans la souris par injection veineuse rétroorbitaire ou par d’autres voies d’injection intraveineuse. À l’aide d’un coton-tige, mettez une petite goutte de larmes artificielles sur chaque œil et allongez la souris sur le côté dans une cage.
   14. Une fois que toutes les souris ont été implantées, confirmez que les animaux reprennent conscience et se déplacent normalement avant de les quitter.
   15. Soins postopératoires : Injecter par voie sous-cutanée 0,3 ml de carprofène dilué (6 mg/kg) et 1,2 ml de solution saline stérile dans chaque souris le lendemain de l’opération. 2 et 3 jours après l’opération, injecter par voie sous-cutanée 1,5 ml de solution saline stérile dans chaque souris. Surveillez les souris et les incisions pendant 10 à 14 jours après la chirurgie. Retirez les clips automatiques et pesez les souris après 10 à 14 jours. note: Les souris sont lentes après la radiation, et l’injection de solution saline empêche les animaux de se déshydrater.
   16. Après 8 à 10 semaines, vérifiez la greffe en saignant les souris et en effectuant une analyse FACS sur le sang périphérique, en colorant des marqueurs tels que CD45, CD3, CD4, CD8 et tous les gènes que le vecteur doit exprimer.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit de microbilles CD34	Miltenyi	Tél. : 130-046-702	Pour le tri des cellules progénitrices CD34+ humaines
Bambanker	Wako	Référence 302-14681	pour cellules de congélation
QIAamp Kit d’ARN viral	Qiagen	Référence 52904	Pour mesurer la charge virale dans le sérum
Cytomètre en flux MACSQuant	Miltenyi		Pour l’analyse de flux
BD LSRFortessa™	BD biosciences		Pour l’analyse de flux
Hyaluronidase	sigma	Réf. H6254-500MG	Pour la digestion des tissus
Désoxyribonucléase I	Worthington	LS002006	pour la digestion des tissus
Collagènase	Technologie de la vie	Référence 17104-019	pour la digestion des tissus
Système de détection PCR en temps réel CFX	Biorad		Pour mesurer la charge virale et l’expression des gènes
Souris, souche NOD. cg-prkdcscid il2rgtm1Wjl/szJ	Le Laboratoire Jackson	Référence 5557	Pour la construction des souris humanisées
Pénicilline Streptomycine (Pen Strep)	Thermo Fisher Scientific	10378016	Pour la culture de cellules
pipéracilline/tazobactam	Pfizer	Zosyn	Antifongique
Amphotéricine B (Fungizone antimycosique)	Thermo Fisher Scientific	Référence 15290-018	Antifongique
AUTOCLIP Pinces de bobinage, 9 mm - 1000 unités	Becton Dickinson	427631	Pour la chirurgie
Blouses chirurgicales stériles Poly-Renforcées Aurora, 30 par caisse	Medline	DYNJP2707	Pour la chirurgie
Sutures, 4-0, vicryl	Owens et Minor	Référence 23000J304H	Pour la chirurgie
Tampons de préparation à l’alcool	Owens et Minor	3583006818	Pour la chirurgie
Gants, chirurgicaux, 6 1/2	Owens et Minor	4075711102	Pour la chirurgie
Milieu cellulaire T sans sérum d'Yssel	Produits Gemini Bio	400 à 102	Pour la transduction des cellules CD34+
Albumine sérique humaine	Sigma-Aldrich	N° A9511	Pour la transduction des cellules CD34+