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1. Assemblage de l’appareil
- Pour garantir la stérilité, allumez la lumière ultraviolette (UV) d’une hotte de culture tissulaire pendant 30 minutes avant de l’utiliser.
- Dévissez une unité de filtre jetable de 25 mm et immergez le capuchon et le fond de l’unité dans un gobelet en verre de 200 ml rempli d’éthanol à 75 % pendant 30 min. L’unité est fabriquée en polypropylène de qualité médicale.
- Prenez le capuchon et le bas de l’appareil à l’aide d’une pince, secouez l’éthanol restant à la main et laissez les pièces sécher à l’air libre pendant 10 minutes dans le capot.
- Mouillez une membrane en polycarbonate de 19 mm dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et placez-la soigneusement sur la matrice de support du bas de l’unité. Le film polymère a une surface lisse et plane et des pores de 3 μm gravés sur piste.
- Remontez l’appareil en vissant fermement le capuchon contre le bas. Assurez-vous que la membrane n’est pas délogée du centre.
- Retirer l’aiguille d’une seringue à insuline de 1 mL et prélever 1 mL de PBS. Fixez la seringue à l’unité de filtration, puis poussez le PBS à travers l’unité pour mouiller l’ensemble et tester s’il y a une fuite.
2. Génération de vésicules à membrane plasmique (PMV)
- Établir une culture de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse, comme l'ont rapporté Nemeth et coll., dans le milieu de culture DMEM (Modified Eagle Medium) de Dulbecco contenant 15 % de sérum fœtal de bovin (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine. Cultivez les cellules dans une plaque à 6 puits dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO2 à 37 °C.
- Pour propager les cellules, retirez le milieu de culture et rincez le puits avec 0,5 ml de PBS sans calcium.
- Ajouter 0,5 mL d’acide trypsine-éthylènediamine tétraacétique à 0,25 % (trypsine-EDTA) et incuber les cellules à 37 °C pendant 3 min. Tapoter la plaque contre la paume de la main à quelques reprises pour faciliter le détachement des cellules. Arrêtez la digestion en ajoutant 1 mL de milieu de culture.
- Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 mL et faire tourner à 200 x g pendant 2 min dans une centrifugeuse de paillasse. Remettre les cellules en suspension dans 4 mL de milieu de culture et aliquote les cellules dans deux puits d’une plaque à 6 puits.
note: Les cellules atteignent généralement la confluence vers 24 h.
- Pour générer des VPP, prélever les cellules d’un puits (environ 5 x 105 cellules) d’une plaque à 6 puits par digestion à la trypsine et monodisperser les cellules dans 0,5 mL de milieu de culture.
- Chargez les cellules dans la seringue à insuline, fixez-la à l’unité de filtre et poussez rapidement le piston pour faire passer les cellules à travers le filtre. Jetez le fluide extrudé car il ne doit y avoir que quelques PMV à l’intérieur.
- Chargez 0,5 ml supplémentaire de fluide dans la seringue et poussez-le rapidement à travers le filtre. Collecte du milieu de la deuxième extrusion, qui contient des PMV de différentes tailles.
- Chargez 150 μL du milieu collecté dans une parabole à fond de verre de 35 mm et laissez les PMV se déposer au fond pendant environ 10 min. Examinez les PMV à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversé équipé d’une caméra CCD à l’aide de l’objectif 20X.