Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Mutagenèse UV pour générer des souches de levure auxotrophes
- Générer des courbes de survie pour déterminer les doses nécessaires d’irradiation ultraviolette (UV)
- Préparez le milieu YPD (extrait de levure, peptone dextrose) et les autres réactifs énumérés au tableau 1 conformément aux procédures standard et inoculez des colonies individuelles dans 5 à 10 ml de milieu YPD. Incuber les cultures sur un tambour à rouleaux à 30 °C O/N jusqu’à saturation pendant au moins 8 heures.
- Déterminer la concentration cellulaire des cultures de nuit (O/N) à l’aide d’un spectrophotomètre en diluant les cellules à 1:10 dans de l’eau dans une cuvette en plastique. Diluer les cellules à une concentration de 10à 7 cellules/ml dans 20 ml d’eau distillée stérile.
- Versez les cellules diluées dans une boîte de Pétri en plastique stérile et, une fois le couvercle retiré, placez la plaque à 14 cm sous une ampoule UV.
- Exposer les cellules à des doses en série de 5 000 μJ et 10 000 μJ d’irradiation UV, en extrayant 500 μl de cellules après chaque incrément de sorte que les cellules soient échantillonnées après exposition à 0 μJ, 5 000 μJ, 10 000 μJ, 15 000 μJ, 20 000 μJ, 25 000 μJ, 30 000 μJ, 40 000 μJ, et 50 000 μJ d’irradiation UV. Transférez les échantillons de cellules extraits dans des tubes stériles de 1,5 ml et diluez-les en série par incréments de 1:10 dans de l’eau stérile.
- Cellules de granulés dans chaque dilution par centrifugation dans une microcentrifugeuse à 16 000 x g pendant 1 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans un volume de 100 μl d’eau stérile appropriée pour le placage des cellules de levure. Pipetez le volume complet des cellules remises en suspension sur des plaques contenant des milieux solides YPD et utilisez un écarteur stérile pour répartir uniformément les cellules sur chaque plaque.
- Enveloppez les bords des plaques dans Parafilm pour éviter le dessèchement des supports et recouvrez les plaques de papier d’aluminium pour prévenir la photo-réactivation et la réparation des mutations induites par les UV. Incuber les plaques à l’envers à 30 °C pendant 2 à 4 jours pour permettre la croissance de colonies de levures viables (figure 1).
- Comptez le nombre de colonies, éventuellement à l’aide d’un stylo pour marquer les colonies comptées, d’un compteur électronique portable ou d’un support de compteur avec grossissement. Représenter le pourcentage du nombre total de cellules en plaques à chaque dose μJ d’irradiation UV pour générer une courbe de survie pour la levure irradiée (figure 2).
REMARQUE : On peut s’attendre à ce que les souches de levure haploïde nécessitent des doses d’irradiation UV plus faibles que les souches diploïdes pour atteindre le même pourcentage de survie. Une souche de levure dépourvue d’enzymes fonctionnelles de réparation de l’ADN, comme le mutant rad1 S. cerevisiae, peut être utilisée comme témoin positif pour indiquer la présence d’une irradiation UV à de très faibles doses.
- Déterminer la dose de mutagénèse UV à utiliser pour le dépistage en se référant à la courbe de survie établie en 1.1.7. La valeur x du point le long de la courbe de survie où y est égal à 50 est la dose d’irradiation UV à laquelle 50 % des levures survivent. Le dépistage de mutants à ce faible pourcentage de survie peut entraîner un rendement plus élevé de souches mutées avec succès, en particulier pour les levures diploïdes. La dose de survie de 50 % pour WT S. boulardii, comme le montre la figure 2, est d’environ 18 000 μJ.
REMARQUE : Bien que des doses UV aussi élevées augmentent le risque de mutations dans les gènes des voies cellulaires autres que le gène marqueur auxotrophe d’intérêt, cet inconvénient doit être mis en balance avec la nécessité d’induire des mutations dans les deux copies du gène marqueur auxotrophe. Pour les souches haploïdes dans lesquelles une seule copie du gène doit être mutée, le dépistage à un pourcentage de survie plus élevé, par exemple à 90 %, diminue le risque de mutations supplémentaires et permet toujours une génération suffisante de mutants auxotrophes.
- Mutagénèse UV et criblage des souches de levures auxotrophes
- Préparez la levure comme décrit aux étapes 1.1.1 à 1.1.3.
- Exposer les levures à la dose d’irradiation UV correspondant à 50 % de survie, telle que déterminée en 1.1.8. Pour WT S. boulardii, cette dose a été déterminée à environ 18 000 μJ (figure 2).
- Prélever 1 ml de volumes de levure et de pastilles irradiées aux UV par centrifugation dans une microcentrifugeuse à 16 000 x g pendant 1 min. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 100 μl d’eau stérile.
- Sélection des mutants
- Si vous utilisez une sélection telle que celle des mutants auxotrophes ura3-, placez la levure irradiée sur un milieu contenant de l’acide 5-fluoroorotique (5-FOA) pour sélectionner les cellules dépourvues d’une enzyme Ura3 fonctionnelle.
REMARQUE : Toute levure contenant des copies fonctionnelles d’Ura3 convertira le 5-FOA en toxine 5-fluorouracile, entraînant la mort cellulaire et permettant une sélection facile des colonies ura3 qui n’ont pas d’Ura3 fonctionnel. Des approches de sélection analogues sont possibles pour le LYS2 et le LYS5 ; TRP1 ;et les marqueurs MET2 et MET15 à l’aide de milieux contenant de l’acide α-aminoadipique ; acide 5-fluoroanthranilique ; et le méthylmercure, respectivement.
- Pipetez les 100 μl de cellules remises en suspension sur un milieu minimal contenant du 5-FOA et utilisez un écarteur stérile pour enrober uniformément la plaque. Enveloppez les plaques dans du Parafilm et incubez à l’envers à 30 °C pendant 2 à 4 jours pour permettre la croissance de colonies de levures viables.
- Confirmer le phénotype ura3- de toute colonie apparaissant sur les plaques 5-FOA en repassant sur les plaques YPD, uracile et 5-FOA (Figure 3). Utilisez la pointe d’un cure-dent stérile pour prélever une partie d’une seule colonie et faites glisser doucement les cellules sur des plaques fraîches de YPD, d’uracile et de 5-FOA. Encore une fois, incubez les assiettes emballées à l’envers à 30 °C pendant 2 à 4 jours.
REMARQUE : Les colonies viables apparaîtront sous la forme d’excroissances surélevées et grossièrement circulaires, tandis que les cellules non viables n’apparaîtront que sous la forme d’une tache opaque sans aucune excroissance en relief (figure 3).
- Criblage des mutants
- Si vous générez un mutant auxotrophe pour lequel il n’existe pas de méthodes de sélection, préparer des dilutions en série 1:10 de cellules de levure irradiées aux UV dans de l’eau stérile et pipeter les dilutions sur un milieu YPD, à l’aide d’un épandeur stérile pour enrober uniformément la plaque.
- Enveloppez les plaques dans du Parafilm et incubez à l’envers à 30 °C pendant 2 à 4 jours. Déterminez quelle dilution a permis la croissance de colonies individuelles qui peuvent être facilement distinguées les unes des autres, généralement pas plus d’environ 100 colonies par plaque.
- Répéter la mutagenèse UV des échantillons de levure décrite aux points 1.2.1-1.2.3 et des cellules sur plaque à cette dilution déterminée. Pipetez la levure diluée sur un milieu YPD, utilisez un épandeur stérile pour répartir les cellules et incubez des plaques emballées à l’envers à 30 °C pendant 2 à 4 jours.
- Dépister les auxotrophes par placage de réplique sur des milieux sélectifs dépourvus du métabolite d’intérêt. Tout d’abord, fixez un tampon de velours stérile sur un support de plaque et retournez la plaque avec des colonies irradiées par UV sur le velours, en marquant l’orientation de la plaque.
- Ensuite, retournez une plaque fraîche dépourvue du métabolite d’intérêt sur le velours et appuyez légèrement pour transférer les cellules du velours à la plaque. Conservez l’assiette d’origine à 4 °C. Enveloppez et incubez la nouvelle assiette à l’envers à 30 °C pendant 2 à 4 jours.
- Comme alternative à la reproduction du placage, criblez les mutants en retraçant les colonies de YPD sur des milieux sélectifs. Utilisez la pointe d’un cure-dent stérile pour prélever une partie d’une seule colonie et faites glisser doucement les cellules sur une plaque YPD fraîche et une plaque dépourvue du métabolite d’intérêt. Incuber à nouveau les assiettes emballées à l’envers à 30 °C pendant 2 à 4 jours.
REMARQUE : Il faut prendre soin de sélectionner des colonies uniques et de les strier plusieurs fois pour confirmer une population homogène de véritables cellules auxotrophes.
- De plus, on confirme le phénotype des cellules irradiées en inoculant des colonies uniques dans 5 à 10 ml de YPD et dans des milieux dépourvus du métabolite approprié (p. ex., dans le milieu uracile pour un mutant ura3). Incuber sur un tambour à rouleaux à 30 °C O/N pour confirmer la croissance des cellules dans le milieu YPD mais pas en l’absence du métabolite.
REMARQUE : Bien que les profils de croissance sur les milieux solides devraient clairement indiquer l’état auxotrophe des levures, il est possible que certaines levures tolèrent les stress et forment de petites colonies à croissance lente sur les milieux solides, mais ne tolèrent pas les mêmes conditions dans les milieux liquides (observations non publiées). L’inoculation dans des cultures liquides doit donc être effectuée pour confirmer soigneusement les schémas de croissance des mutants irradiés par UV.
- Pour le stockage à long terme des mutants auxotrophes confirmés, préparer les stocks de glycérol en inoculant les cellules dans 10 ml de YPD et en les incubant sur un tambour à rouleaux O/N à 30 °C. Cellules de granulés par centrifugation pendant 3 min à 2 500 x g et aspirer le milieu. Remettre les cellules en suspension dans du glycérol filtré stérile à 50 %, les transférer dans un cryoflacon et les stocker à -80 °C.
REMARQUE : Les levures mutagénisées par les UV peuvent contenir des mutations dans plusieurs gènes autres que dans le marqueur auxotrophe d’intérêt. Avant de poursuivre l’utilisation de mutants auxotrophes vérifiés, ces souches doivent être analysées plus en détail par séquençage génétique et évaluation de la résistance au pH, aux stress hydriques biliaires et à d’autres caractéristiques pertinentes pour les souches probiotiques, comme décrit ailleurs2. De plus, l’utilisation de l’homologie PCR ou du ciblage CRISPR/Cas9 pour muter plus sélectivement les marqueurs auxotrophes devrait être envisagée comme alternative à la mutagenèse UV.
2. Transformation de la levure
- Transformation LiOAc de la levure
- Inoculer des colonies de levures individuelles dans 5 à 10 ml de milieu YPD et incuber sur un tambour à rouleaux à 30 °C O/N.
- Pour induire la croissance de la phase logarithmique et augmenter l’efficacité de l’absorption du plasmide, déterminez la concentration cellulaire à l’aide d’un spectrophotomètre pour mesurer une dilution de 1:10 des cellules dans de l’eau stérile dans une cuvette en plastique. Diluer les cultures O/N à une densité optique à 600 nm (OD600) de 0,16-0,2 (environ 2 x 106- 2,5 x 106 cellules/ml) dans 50 ml de YPD frais et chauds et incuber des cellules sur une plate-forme orbitale agitée réglée à 200 tr/min jusqu’à ce que la culture atteigne environ 1 x 107 cellules/ml, généralement vers 4 h
REMARQUE : L’efficacité de la transformation peut être mesurée en fonction du nombre d’unités formant des colonies de levure (UFC) transformées avec succès par μg d’ADN plasmidique. Une efficacité accrue se traduit par un plus grand nombre de colonies transformées par μg d’ADN plasmidique. La sous-culture et la collecte des cellules de levure pendant la croissance en phase logarithmique sont l’un des facteurs qui augmentent l’efficacité de la transformation.
- Cellules à granulés par centrifugation à 2 500 x g pendant 3 min.
- Aspirez le surnageant et transférez les cellules dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml en remettant la pastille en suspension dans 1 ml d’eau stérile.
- Cellules de granulés par centrifugation à 16 000 x g pendant 1 min dans une microcentrifugeuse, aspiration du surnageant et lavage des cellules par remise en suspension dans 1 ml de tampon TE/LiOAc (Tris EDTA/acétate de lithium).
- Répéter la centrifugation et remettre en suspension les cellules dans le tampon TE/LiOAc à une concentration de 2 x 109 cellules/ml.
- Préparez des mélanges de transformation avec chacun des éléments suivants : 50 μl de levure préparée dans un tampon TE/LiOAc, 5 μl d’ADN porteur (10 μg/μl) et 1 μl d’ADN plasmidique (1 μg). Des microgrammes d’ADN plasmidique peuvent être titrés, car des quantités croissantes d’ADN peuvent ou non conduire à une efficacité de transformation accrue.
REMARQUE : Pour une souche de levure mutante dépourvue d’un marqueur auxotrophe, un seul plasmide codant pour le marqueur peut être transformé par échantillon. De plus, l’utilisation d’un plasmide codant pour une protéine facilement détectable, telle que la protéine fluorescente verte (GFP), permettra de déterminer efficacement le repliement et l’expression corrects de la protéine hétérologue par la souche de levure après la transformation.
- À chaque préparation, ajoutez 300 μl de PEG/LiOAc/TE et tourbillonnez soigneusement. L’incubation de cellules intactes avec du polyéthylène glycol (PEG) est essentielle pour une transformation efficace.
- Incuber les préparations à 30 °C pendant 30 min avec agitation en plaçant les tubes de microcentrifugation dans un bécher posé sur un agitateur à plate-forme orbitale à 200 tr/min.
- Ajoutez 35 μl de diméthylsulfoxyde (DMSO) à chaque réaction et cellules de choc thermique pendant 15 min dans un bain-marie à 42 °C. Bien qu’il existe des rapports contradictoires sur les avantages supplémentaires du DMSO, il a été démontré que le choc thermique des cellules de levure intactes augmente considérablement l’efficacité de la transformation.
- Laver les cellules par granulation par centrifugation comme au point 2.1.5, en aspirant ou en pipetant le surnageant et en la remettant en suspension dans 1 ml d’eau stérile. Pipetez doucement de haut en bas pour briser la pastille cellulaire.
REMARQUE : Il est essentiel d’éliminer complètement le surnageant car le milieu utilisé pour générer des cellules compétentes peut inhiber la croissance des levures et la formation de colonies.
- Répéter la granulation cellulaire comme au point 2.1.5, aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 100 μl d’eau stérile. Pipetez tout le volume sur une plaque sélective et utilisez un écarteur stérile pour enrober uniformément la plaque de levure transformée.
- Enveloppez les bords des plaques revêtues dans du Parafilm pour éviter le dessèchement du milieu et incubez à l’envers à 30 °C pendant 2 jours pour permettre la croissance des cellules de levure transformées. Une transformation réussie et efficace et une sélection auxotrophe de Saccharomyces cerevisiae donnent un nombre élevé de colonies par préparation de transformation, bien que le rendement puisse être beaucoup plus faible pour d’autres souches (Figure 4).
- Conservez les plaques de levure à court terme (généralement de 1 à 3 semaines) à l’envers et à 4 °C. Préparez des stocks de glycérol de levure transformée comme décrit au point 1.2.5 pour un stockage à long terme.
REMARQUE : D’autres études testant les UFC transformées sont nécessaires pour déterminer la stabilité du plasmide et évaluer l’expression correcte de la protéine hétérologue. Des descriptions détaillées de la stabilité plasmidique, de l’utilisation de l’immunotransfert pour détecter les protéines dénaturées récupérées à partir d’échantillons cellulaires, du test immuno-enzymatique (ELISA) pour détecter les protéines tridimensionnelles correctement repliées et de l’utilisation de la GFP dans les études sur la levure sont disponibles ailleurs. La figure 5 montre une image représentative de l’expression réussie de la GFP chez S. cerevisiae transformépar rapport aux cellules non transformées. L’utilisation d’une telle protéine fluorescente est un moyen de déterminer efficacement la production réussie de protéines hétérologues.
- Électroporation de levure
- Inoculer des colonies de levures individuelles dans 5 à 10 ml de milieu YPD et incuber sur un tambour à rouleau à 30 °C O/N.
- Déterminer la concentration des cellules à l’aide d’un spectrophotomètre pour mesurer une dilution de 1:10 des cellules dans de l’eau stérile. Diluer les cultures O/N dans 100 ml de milieu YPD frais et chaud jusqu’à un équivalent OD600 d’environ 0,3. Incuber les sous-cultures à 30 °C sur un agitateur de plate-forme orbitale réglé à 200 tr/min jusqu’à ce qu’ils atteignent une DO600 d’environ 1,6, généralement 4-5 heures. Chaque sous-culture de 100 ml générera suffisamment de cellules conditionnées pour deux réactions de transformation.
- Cellules de granulés par centrifugation à 2 500 x g pendant 3 min. Aspirer le surnageant et laver les cellules en les remettant en suspension dans 50 ml d’eau stérile glacée. Répétez le lavage en granulant les cellules, en aspirant le surnageant et en les remettant en suspension dans de l’eau fraîche et stérile glacée de 50 ml.
- Granulez à nouveau les cellules et mettez-les en suspension dans 50 ml de tampon d’électroporation glacé (1 M de sorbitol, 1 mM de chlorure de calcium (CaCl2)).
- Répéter le spin comme dans la section 2.2.3, aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 20 ml de LiOAc 0,1 M et 10 mM de dithiothréitol (DTT). Incuber la suspension cellulaire sur un tambour à rouleaux à 30 °C pendant 30 min. La préincubation des cellules dans le LiOAc et le DTT augmente en synergie l’efficacité de l’électroporation.
- Granulez les cellules comme au point 2.2.3, retirez le surnageant et lavez-les en les mettant en suspension dans 50 ml de tampon d’électroporation glacé. Répétez la centrifugation et remettez en suspension les cellules dans un tampon d’électroporation glacé jusqu’à un volume final de 1 ml.
- Préparez sur glace : des cellules de levure conditionnées, des cuvettes d’électroporation stériles et de l’ADN plasmidique. Immédiatement après la remise en suspension finale des cellules conditionnées dans un tampon d’électroporation de 1 ml, combinez des cellules de levure conditionnées de 400 μl avec environ 1 μg d’ADN plasmidique et ajoutez-les à une cuvette d’électroporation glacée de 0,2 μm. L’utilisation de quantités accrues d’ADN peut légèrement augmenter l’efficacité de la transformation. Incuber la réaction sur de la glace pendant 5 min, puis électroporer avec l’électroporateur réglé à 2,5 kV et 25 μF.
REMARQUE : Comme décrit à la section 2.1.7, une souche de levure mutante dépourvue d’un marqueur auxotrophe peut être transformée avec un seul plasmide codant pour le marqueur muté par échantillon. De plus, l’utilisation d’un plasmide qui code pour une protéine facilement détectable telle que la GFP permet de déterminer efficacement le repliement et l’expression corrects de la protéine hétérologue après la transformation.
- Transvaser les cellules électroporatives dans 8 ml d’un mélange 1:1 de sorbitol YPD :1 M et laisser les cellules incuber sur un tambour à rouleaux à 30 °C pendant 60 min.
- Cellules à granulés comme dans 2.2.3 et remises en suspension dans 100 μl de sorbitol 1:1 YPD :1 M. Plaquez tout le volume sur un milieu sélectif contenant 1 M de sorbitol, enveloppez les bords des plaques dans du Parafilm et incubez les plaques à l’envers à 30 °C pendant 2 à 5 jours pour permettre la croissance des cellules de levure transformées.
REMARQUE : Il est essentiel de tester la levure transformée pour évaluer l’expression correcte de la protéine hétérologue, comme décrit aux sections 2.1.14 et 2.2.7.
- Gavage oral de souris avec de la levure transformée
- Effectuer toutes les procédures de soin et de manipulation des animaux conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et à l’approbation du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux.
- Préparez des cultures de levures O/N en inoculant des colonies uniques de levure auxotrophe transformée dans 5 à 10 ml de milieu sélectif. Incuber les cultures O/N pendant au moins 8 heures sur un tambour roulant à 30 °C jusqu’à saturation.
REMARQUE : L’utilisation de protéines d’essai codant pour des plasmides, telles que la GFP, facilitera les tests d’expression des protéines chez la levure gavée, comme décrit en 4.7.
- Pour une induction maximale de l’expression des protéines et pour induire la croissance en phase logarithmique, préparer des sous-cultures à partir des cultures O/N en les diluant à un équivalent OD600 d’environ 0,16-0,2 dans 50 ml de milieu approprié comme décrit au point 2.1.2.
- Déterminer la concentration de cellules sous-cultivées comme à l’alinéa 1.1.2 et ajuster à 109 cellules/ml. Préparer une dose de 100 μl pour chaque souris, avec quelques centaines de μl de volume supplémentaire par groupe pour améliorer la précision et faciliter le chargement de l’échantillon.
- Cellules à granulés par centrifugation à 2 500 x g pendant 3 min ou dans une microcentrifugeuse à 16 000 x g pendant 1 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules en ajoutant un volume égal d’eau stérile et en pipetant doucement de haut en bas.
- Fixez une aiguille de gavage de calibre approprié (22 G pour les souris de 15 à 20 g) sur une seringue stérile de 1 ml et chargez l’échantillon de levure, en veillant à éliminer les bulles et en réglant le piston sur un incrément de 100 μl. Chargez une seringue supplémentaire avec de l’eau stérile pour gavage les souris témoins et vérifiez la présence de levures contaminantes.
- Prenez la souris à gaver à l’aide de la main non dominante, l’index et le pouce serrant fermement la peau autour du cou (Figure 5A). Rentrez la queue sous le petit doigt pour éviter tout mouvement du bas du corps. Assurez-vous que la prise est bien sûre et qu’elle empêche la souris de bouger la tête afin d’éviter d’endommager les tissus internes pendant le gavage.
REMARQUE : Estimez jusqu’où l’aiguille de gavage doit être insérée en tenant l’aiguille contre la souris de manière à ce que le bulbe soit au même niveau que le processus xiphoïde du sternum. L’insertion de cette longueur d’aiguille permettra généralement au bulbe de l’aiguille de gavage de pénétrer dans l’estomac.
- À l’aide de la main dominante, insérez doucement l’aiguille de gavage dans l’œsophage de la souris en inclinant l’aiguille le long du toit de la bouche et à l’arrière de la gorge, en gardant légèrement à gauche du centre. Attendez que la souris avale le bulbe de l’aiguille et laissez l’aiguille descendre légèrement plus loin jusqu’au point estimé en 3.7 (Figure 5B). Si une résistance est ressentie lors de l’insertion de l’aiguille de gavage ou si la souris commence à haleter à un moment donné, retirez doucement l’aiguille et essayez à nouveau de trouver l’œsophage.
- Une fois que la souris a avalé le bulbe de l’aiguille de gavage, appuyez doucement sur le piston de la seringue pour administrer 100 μl (108 UFC) de levure directement dans l’estomac de la souris.
REMARQUE : Bien que les souris soient incapables de vomir la solution gavée après l’administration, il est possible qu’un reflux se produise pendant le gavage. L’insertion correcte de l’aiguille de gavage, ainsi que l’ajustement du volume et de la viscosité de la solution, peuvent aider à limiter le reflux et à assurer un dosage précis.
- Retirez délicatement l’aiguille du gavage de l’estomac et de l’œsophage de la souris et remettez la souris dans la cage. Vérifiez que la souris respire et bouge normalement après le gavage pour vous assurer que l’aiguille du gavage a été correctement insérée tout au long de la procédure et qu’aucune solution n’a été aspirée.
Table 1. Liste des réactifs. Sont décrits les réactifs nécessaires à la fabrication de chacune des solutions, des milieux et des plaques de levure, ainsi que des tampons de transformation utilisés pour les protocoles de ce manuscrit.
| Solutions | Milieux et plaques de levure | Réactifs de transformation |
| Polyéthylène glycol (PEG) 50 % : | YPD : | TE/LiOAc : |
| 250 g de PEG 3350 | 20 g de peptone | 50 ml 10x TE |
| 500 ml d’eau stérile | 20 g de dextrose | 50 ml 10x (1M) LiOAc |
| Filtre stérilisé | 10 g d’extrait de levure | 400 ml d’eau stérile |
| 1 L d’eau | Filtre stérilisé |
| autoclave | |
| TE 10x : | Plaques YPD : | PEG/TE/LiOAc : |
| 100 mM Tris | 20 g de peptone | 400 ml de PEG 50 % |
| 10 mM d’EDTA | 20 g de dextrose | 50 ml 10x TE |
| pH à 7,5 et stérilisation par filtre | 20 g de gélose | 50 ml 10x (1M) LiOAc |
| 10 g d’extrait de levure | |
| 1 L d’eau | |
| autoclave | |
| 20 % de glucose : | Milieux sélectifs de l’uracile | ADN du porteur (ADN SS) : |
| 200 g de dextrose | 2 g de mélange d’acides aminés sans uracile | Conserver à -20 °C et avant utilisation, chauffer pendant 1 à 2 min à 100 °C pour faire fondre les brins et stocker sur de la glace |
| 1 L d’eau | 6,7 g de base azotée de levure sans acides aminés | |
| Filtre stérilisé | 1 L d’eau | |
| Stériliser par autoclave ou filtrage stérile | |
| Ajouter 20 % de glucose 1:10 avant utilisation | |
| 50 % de glycérol : | Plaques d’uracile : | Tampon d’électroporation : |
| 500 ml de glycérol | Dans une fiole de 250 ml : | 1 M de sorbitol |
| 500 ml d’eau | 2 g de mélange d’acides aminés sans uracile | 1 mM CaCl2 |
| autoclave | 6,7 g de base azotée de levure sans acides aminés | Remplissez d’eau distillée |
| 150 ml d’eau | Autoclave et stockage à 4 °C |
| Dans une fiole de 2 L : | |
| 20 g de gélose | |
| 750 ml d’eau | |
| Flacons d’autoclave séparément, puis mélanger avec 100 ml de glucose à 20 % | |
| Terminer l’IMDM | Plaques 5-FOA+ : | LiOAc/TNT |
| 500 ml de média Dulbecco's modifié d'Iscove | Autoclave dans une fiole de 2 L : | 0,1 M LiOAc |
| 5 ml de pénicilline streptomycine glutamine 100x | 20 g de gélose | 10 mM TNT |
| 500 μl de 2-mercaptoéthanol | 750 ml d’eau | |
| 10 % de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur | mélanger: | |
| 2,5 ml de pyruvate de sodium 100 mM | 6,7 g de base azotée de levure sans acides aminés | |
| 2 g de mélange d’acides aminés sans uracile | |
| 150 ml d’eau tiède | |
| Une fois refroidi, ajoutez : | |
| 0,05 g d’uracile en poudre | |
| 1 g de 5-FOA | |
| Remuer et filtrer stériliser | |
| Ajouter à la solution de gélose autoclavée | |
| Mélanger avec 100 ml de glucose à 20 % | |
