Génération de neutrophiles associés aux tumeurs anti-angiogéniques

Résumé

Source : Pylaeva, E., et al. Transfert de neutrophiles manipulés associés à des tumeurs chez des souris porteuses de tumeurs pour étudier leur potentiel angiogénique in vivo. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo montre un test permettant de générer des neutrophiles associés aux tumeurs (TAN) anti-angiogéniques. Lors de la prise d’une tumeur de mélanome murin contenant des TAN pro-angiogéniques, les cellules uniques sont isolées à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et traitées avec un inhibiteur de la nicotinamide phosphoribosyl transférase (NAMPT) pour réduire la capacité à stimuler l’angiogenèse.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

REMARQUE : Le schéma général du protocole est illustré à la Figure 1.

1. Préparation de la lignée cellulaire de mélanome B16F10

1. Préparez des cellules mycoplasmiques négatives cultivées en une monocouche confluente à 90 % (environ 10 x 10⁶ cellules/fiole T75) dans le milieu Dulbecco's modifié complet d'Iscove (IMDMc : IMDM + 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS) + 1 % de pénicilline-streptomycine).
2. Retirez le milieu et rincez les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Appliquer 6 mL d’une solution de décollement cellulaire contenant des enzymes protéolytiques et collagénolytiques (voir le tableau des matières) et incuber à 37 °C pendant 2 min.
3. Frappez doucement le ballon pour mobiliser les cellules adhérentes restantes par le bas. Prélever la suspension cellulaire dans des tubes de 15 mL et centrifuger à 300 x g pendant 7 min et 20 °C.
4. Retirer le surnageant et bien remettre la pastille en suspension dans 1 mL de PBS. Ajouter 14 mL de PBS et centrifuger (300 x g et 20 °C pendant 7 min).
5. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de PBS.
6. Comptez les cellules et mettez-les en suspension à la concentration de 3 x 10⁶/mL de PBS (pour l’étape 2) ou de 6 x 10⁶/mL de PBS (pour l’étape 6) pour l’injection. Gardez les cellules sur la glace pendant un maximum de 30 min.

2. Modèle de tumeur allogénique chez la souris

1. Utilisez 10 souris Ifnar1-/- femelles âgées de 8 à 12 semaines qui sont élevées dans des conditions exemptes d’agents pathogènes spécifiques (SPF).
   note: Les souris femelles sont préférables dans un modèle sous-cutané de croissance tumorale, car les mâles sont plus agressifs et donc sujets à des infractions du site tumoral, ce qui influence la croissance tumorale.
2. Rasez la peau de la souris sur le flanc avec un rasoir électrique et désinfectez la peau avec des tissus humides avec de l’éthanol à 70 %.
3. Prélever les cellules de mélanome B16F10 préparées à une concentration de 3 x 10⁶/mL de PBS (voir l’étape 1) dans une seringue de 1 mL et une aiguille de 0,4 x 19 mm. Injecter 100 μL de la suspension par voie sous-cutanée.
   1. Mélangez bien les cellules avant chaque injection. Utilisez des aiguilles d’au moins 0,4 mm de diamètre pour ne pas déranger les cellules tumorales.
4. Placez jusqu’à 5 souris dans une cage et contrôlez la taille de la tumeur (longueur, largeur et profondeur) avec un pied à coulisse pendant 14 jours.
   note: Selon la réglementation sur les animaux, la taille de la tumeur ne doit pas dépasser 15 mm de diamètre, les souris avec des tumeurs plus grandes ou nécrotiques/ouvertes doivent être sacrifiées au préalable.
5. Au jour 14, sacrifiez les souris dans la chambre de CO₂.
6. Désinfectez la peau avec de l’éthanol à 70 % et éliminez les tumeurs avec des ciseaux et des pinces dans une boîte de Pétri stérile. Conservez les tumeurs dans un tube de 50 ml dans le milieu complet Dulbecco's Modified Eagle (DMEMc : DMEM + 10 % FBS + 1 % de pénicilline-streptomycine) sur de la glace.

3. Isolation TAN

1. Placez les tumeurs dans des plaques stériles à 6 puits, 5 tumeurs par puits. Coupez les tumeurs en morceaux de 2-3 mm avec des ciseaux stériles.
   1. Digérer avec 1 mL de solution de dispase/collagénase D/DNase I (0,2 mg/0,2 mg/100 mg dans 1 mL de DMEMc) par tumeur. Incuber à 37 °C, 5 % de CO₂ dans un incubateur humide, et mélanger avec une seringue de 10 mL sans aiguille toutes les 15 min 3 fois.
2. Pour éliminer les fibres non digérées, maillez les cellules à travers des filtres de 100 μm dans des tubes de 15 mL (un puits par filtre et par tube). Ajouter du PBS à 15 mL, des tubes à centrifuger à 460 x g, 4 °C pendant 5 min, et retirer le surnageant.
3. Lyser les érythrocytes avec un tampon de lyse (NH₄Cl 150 mM, KHCO₃ 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,3, 20 °C) en ajoutant 1 mL dans chaque tube. Mélangez bien et combinez la solution de tous les tubes en un seul. Arrêtez la réaction après 2 minutes avec 11 mL de DMEMc glacé (4 °C).
4. Centrifuger à 460 x g, 4 °C pendant 5 min, et retirer le surnageant. Remettre la pastille en suspension avec 15 mL de PBS froid. Centrifuger à 460 x g, 4 °C pendant 5 min, et retirer le surnageant.
5. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de PBS. Ajouter 3 μL d’anticorps anti-Fc (CD16/CD32, stock 0,5 mg/mL) et incuber sur glace pendant 15 min.
6. Ajouter des anticorps : 10 μL de Ly6G-phycoérythrine (Ly6G-PE, stock 0,2 mg/mL) et 10 μL de CD11b-allophycocyanine (CD11b-APC, stock 0,2 mg/mL). Ajouter 20 μL de colorant de viabilité 6-Diamidin-2-phénylindol (DAPI, stock 5 mg/mL) et incuber sur glace dans l’obscurité pendant 30 min
   note: Une autre combinaison de colorants de viabilité et de conjugués fluorescents d’anticorps peut être utilisée.
7. Ajouter du PBS jusqu’à 15 ml, centrifuger à 460 x g, 4 °C pendant 5 min, et retirer le surnageant.
8. Remettre la pastille en suspension dans le DMEMc à la concentration d’environ 10 x 10⁶/mL et la maintenir sur de la glace.
9. Triez les neutrophiles CD11b⁺ Ly6G^hi alive (DAPI-négatif) à l’aide d’un trieur de cellules activé par fluorescence (stratégie de déclenchement voir figure 2).
   note: Maintenez le tube avec suspension cellulaire et le tube avec DMEMc pour cellules triées à 4 °C. Utilisez les paramètres de tri optimaux suivants : une buse de 70 μm, un débit seuil de 22 000 événements/seconde maximum et un débit de 1 à 3.
10. Vérifiez la pureté des neutrophiles triés à l’aide d’un cytomètre pour une pureté recommandée de >95 %.
11. La centrifugeuse a trié les neutrophiles à 460 x g, 4 °C pendant 5 min, et a retiré le surnageant. Remettre en suspension les cellules triées dans DMEMc à la concentration de 1 x 10⁶/mL.
    note: Le nombre attendu de neutrophiles dans une tumeur B16F10 de 14 jours (10 mm de diamètre) est d’environ 3 x 10⁴ cellules.

4. Inhibition de NAMPT dans les TAN in vitro

1. Préparer la matière première du FK866 (inhibiteur de NAMPT) dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) à une concentration finale de 100 mM.
2. Grainez les neutrophiles triés (étape 3.11) dans les 2 puits d’une plaque à fond en U de 96 puits (1,5 x 10,⁵ neutrophiles/puits). Ajouter du FK866 dans le puits d’intervention (concentration finale de 100 nM) et une quantité égale de DMEMc et de DMSO dans le puits témoin. Incuber pendant 2 h à 37 °C, 5 % de CO₂ dans un incubateur humide.
3. Centrifuger à 460 x g, 4 °C pendant 5 min, et retirer le surnageant. Remettre en suspension dans 200 μL de PBS dans chaque puits. Répétez l’opération 2 fois.
4. Centrifuger à 460 x g, 4 °C pendant 5 min, et retirer le surnageant. Remise en suspension dans un milieu commercial de croissance des cellules endothéliales (complété par un supplément de croissance des cellules endothéliales de 4 μL/mL, un facteur de croissance épidermique humain recombinant 0,1 ng/mL, un facteur de croissance des fibroblastes humains basiques recombinant de 1 ng/mL, une héparine de 90 μg/mL et de l’hydrocortisone de 1 μg/mL) jusqu’à une concentration finale de 0,2 x 106 cellules/mL (dans 0,75 mL) (pour l’étape 5) ou dans du PBS jusqu’à la concentration finale de 0,6 x 10⁶ cellules/mL ( dans 0,25 mL).

Résultats

Graphique 1. Le schéma du protocole. Étape 1. Préparation de la lignée cellulaire de mélanome B16F10 ; 2. Modèle de tumeur allogénique chez la souris ; 3. Isolement des TAN des tumeurs ; 4. Inhibition de NAMPT dans les TAN in vitro ; 5. Estimation des propriétés angiogéniques des TAN dans le dosage de l’anneau aortique ; 6. Transfert adoptif de neutrophiles traités dans le modèle de tumeur all...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes de 15 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Allemagne	6,25,54,502
Tubes de 50 ml	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Allemagne	227261
Pointes stériles de 5 ml / 10 ml / 25 ml pour la pipette automatique	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Allemagne	6006180 / 607180 / 760180
6 plaques de culture cellulaire à fond plat	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Allemagne	8 33 920
Plaques de culture cellulaire à fond plat à 96 puits	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Allemagne	Référence 655180
Plaques de culture cellulaire à fond en U de 96 puits	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Allemagne	Référence 65018
anti-souris CD11b	BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, États-Unis	553312	clone M1/70, conjugué APC, 0,2 mg/mL
anti-souris Ly6G	BioLegend, Californie, États-Unis	127608	clone 1A8, conjugué au PE, 0,2 mg/mL
BD FACS AriaII	BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, États-Unis		trieur de cellules
étrier	Vogel Germany, Kevelaer, Allemagne
Compteur de cellules Casy	Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Allemagne
Filtres stériles Cell Trics 50μm / 100 μm	Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Allemagne	Tél. : 04-004-2327 / 04-004-2328
Centrifugeuse Rotina 420 R	Andreas Hettich, Tuttlingen, Allemagne	Réf. 4706
Collagénase D	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Allemagne	11088858001
DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole, dilactate)	BioLegend, Californie, États-Unis	422801	Stock : 5mg/ml
Dispase I	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Allemagne	D4818-2MG
DMEM	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, États-Unis	Référence 41966-029	DMEM complet : DMEM + 10 % FBS + 1 % pénicilline-streptomycine
DMSO (diméthylsufoxide)	WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Allemagne	WAK-DMSO-10	CryoSure-DMSO
DNase I	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Allemagne	DN25-100MG
Le	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, États-Unis	Référence 14190-094
Milieu de croissance des cellules endothéliales	PromoCell, Heidelberg, Allemagne	C-22010
FBS (Sérum de Bovin Fœtal)	Biochrom, Berlin, Allemagne	Réf. S0115
Bloc Fc (Anti-souris CD16/32)	BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, États-Unis	553142	clone 2.4G2, Stock : 0.5mg/mL
Chlorhydrate FK 866	Axon Medchem, Groningue, Pays-Bas	Axon 1546	Stock : 100 mM
Chèvre Anti-Lapin IgG H&L	Abcam, Cambridge, Royaume-Uni	AB97075	Conjugué au Cy3, stock : 0,5 mg/mL
Incubateur CO2 Heracell 240i	Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis	51026334
IMDM	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, États-Unis	Référence 12440-053	IMDM complet : IMDM + 10 % FBS + 1 % pénicilline-streptomycine
Rasoir Isis GT420	B. Braun Asculap, Suhl, Allemagne	90200714
Membrane basale Matrigel Matrix	Corning Life Sciences, Amsterdam, Pays-Bas	7205011
Anti-actine monoclonale, muscle α-lisse	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Allemagne	Réf. F3777	FITC conjugué, aucune information sur la concentration des stocks
Aiguilles 0,4 mm x 16 mm	BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, États-Unis	Référence 302200
Neomount	Merck, Darmstadt, Allemagne	HX67590916
Sérum de chèvre normal	Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, États-Unis	Référence : 005-000-121
Pénicilline Streptomycine	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, États-Unis	Référence 15140-122
Pipette automatique Pipetus	Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Allemagne	Référence 9907200
Couche anti-effacement ProLong Gold avec DAPI	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, États-Unis	Réf. P36935
lapin anti souris Laminine gamma 1 chaîne	Immundiagnostik, Bensheim, Allemagne	AP1001.1	Aucune information sur la concentration des actions
StemPro Accutase	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, États-Unis	Référence A1105-01
Scalpel d’élimination stérile (n° 15)	MedWare, Naples, États-Unis	Référence 120920
Seringues 1 ml	BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, États-Unis	303172
Seringues 10 ml	BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, États-Unis	Référence 309110
Fioles stériles de culture cellulaire T75	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Allemagne	83,39,11,302