Technique de conjugaison avidine-biotine pour présenter des antigènes cibles sur Mycobacterium bovis BCG

Résumé

Source : Liao, T. A., et al., Expression d’antigènes exogènes dans le vaccin BCG de Mycobacterium bovis via une décoration de surface non génétique avec le système avidine-biotine. J. Vis. Exp. (2018).

La vidéo montre une technique de chargement d’antigènes sur Mycobacterium bovis BCG pour améliorer ses propriétés immunogènes. La méthode utilise le système avidine-biotine pour recouvrir la surface bactérienne d’antigènes exogènes.

Protocole

1. Biotinylation de la surface cellulaire du BCG

1. Cultivez du BCG dans un bouillon Middlebrook 7H9 avec 10 % d’OADC (solution d’acide oléique, d’albumine et de dextrose) et 0,05 % de Tween 80 à 37 °C sur une plate-forme agitée à 50 tr/min jusqu’à ce que OD = 0,5-1,
   REMARQUE : Le BCG est un agent pathogène de biosécurité de niveau 2 et toutes les expériences concernant le BCG doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité avec un équipement de protection individuelle approprié.
2. Laver 10^{à 9} BCG 3 fois avec 500 μL de PBS glacé sans endotoxines plus 0,1 % de Tween80 (PBST) (pH 8,0). Suspendre la pastille BCG dans du PBS stérile sans endotoxines.
3. Immédiatement avant l’utilisation, préparer 1 mL de 10 mM de biotine Sulfo-NHS SS dans de l’eau filtrée stérile.​
   1. Incuber les bactéries avec 1 mL de 0,5 mM de biotine Sulfo-NHS SS à température ambiante pendant 30 min.
4. Lavez les bactéries marquées 3 fois avec 500 μL de PBST glacé à froid pour éliminer le réactif de biotinylation n’ayant pas réagi.
   1. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de PBST.

2. Liaison de la protéine monomère de fusion d’avidine à la surface biotinylée du BCG

1. Mélanger 5 x 10⁸ BCG biotinylé avec de la protéine Avi (10 μg/mL final dans PBS-T) pendant 1 h à température ambiante sur une plate-forme agitée.
2. Laver les bactéries 3 fois avec 500 μL de PBST glacé à froid.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RPMI 1640 sans endotoxines	Technologies StemCell	Référence 36750
Biotine Sulfo-NHS SS	Thermo Fisher	Référence 21328
Bouillon Middlebrook 7H9	Systèmes de diagnostic BD	Référence 271310
L’OADC	Systèmes de diagnostic BD	Réf. B11886
Préadolescent 80	Sigma-Aldrich	Réf. P1379