Etude in vitro de la stimulation microgliale induite par le β-glucane
1. Culture cellulaire de cellules de glioblastome et de microglie de souris dans des lames de chambre à 8 puits
NOTE : Ce protocole est spécifique pour les lignées cellulaires GL261 (glioblastome) et BV2 (microglie). Cependant, avec de légères modifications, ces étapes pourraient potentiellement être utilisées pour étudier d’autres lignées cellulaires cancéreuses et immunitaires.
- Préparez le milieu complet Eagle's modifié de Dulbecco (DMEM) modifié avec de la L-glutamine, 4,5 g/L de D-glucose et sans pyruvate. Ajouter 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine. Préchauffez le matériau dans un bain-marie à 37 °C pendant 15 min.
- Décongelez les aliquotes BV2 et GL261 congelées dans un bain-marie (37 °C) pendant 2 min, et juste avant qu’elles ne dégèlent complètement, transportez-les dans une hotte à flux laminaire et plaquez les cellules dans deux flacons stériles T25 différents (un pour chaque lignée cellulaire).
- Incuber les flacons T25 à 37 °C, 5 % CO2 jusqu’à ce que la culture soit confluente.
note: En fonction des conditions de congélation et du temps de cryoconservation, le temps jusqu’à la confluence peut varier. Ces lignées cellulaires ont généralement besoin de 3 à 5 jours pour atteindre la confluence dans une fiole T75.
- Une fois que la culture cellulaire BV2 est devenue confluente, transférez-la dans des lames de chambre à 8 puits 0,6 x 106 cellules/puits. Conservez les lames de la chambre à 8 puits dans l’incubateur pendant 24 h.
- Une fois que les cellules microgliales sont plaquées dans les lames de chambre à 8 puits, répétez le même protocole avec les cellules GL261.
2. Activation de la microglie avec des β-glucanes
- Enduisez les cellules BV2 avec quatre β-glucanes différents (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum et H. erinaceus) à une concentration de 0,2 mg/mL pendant 72 h. Une condition expérimentale doit rester non traitée (milieu normal), agissant comme le groupe témoin.
- Prélever le surnageant à l’aide d’une pipette après 72 h et passer le volume restant à travers un filtre à seringue de 0,20 μm. Ensuite, congelez le surnageant à -80 °C pendant au moins 24 h.
3. Traitement du GL261 avec un milieu conditionné par la microglie pré-activé
- Une fois que le GL261 est confluent à 80 % dans les lames de la chambre à 8 puits, ajouter un milieu microglial traité au β-glucane à une concentration volumique finale de 25 % pendant 72 h (volume total : 250 μl/puits).
