Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Isolement de la rate chez la souris
- Préparer 1640 RPMI (Roswell Park Memorial institute) : 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 0,10 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES), 1 mM de pyruvate de sodium, 50 μM de β-mercaptoéthanol et 1 % de pénicilline/streptomycine.
- Euthanasier des souris mâles C57bl/6 âgées de 10 à 12 semaines par inhalation de CO2. Vaporisez la poitrine et les côtés de la souris avec de l’éthanol à 70 %. Sur le côté gauche, ouvrez soigneusement la peau et la cavité péritonéale pour exposer la rate.
- À l’aide de petites pinces, déplacez prudemment les intestins et le foie vers le côté gauche de la souris et, à l’aide de ciseaux fins, excisez doucement la rate.
note: Cette étape doit être effectuée avec beaucoup de soin, car des dommages au tractus gastro-intestinal peuvent induire une contamination.
- Placez chaque rate excisée dans un tube conique de 15 mL étiqueté contenant 3 mL de milieu RPMI 1640.
2. Génération de suspensions unicellulaires à partir de la rate
REMARQUE : La rate peut être dissociée en une suspension unicellulaire en combinant la dissociation mécanique et la digestion enzymatique.
- Préparez la solution de digestion de la rate en ajoutant de la collagénase D (1 mg/mL ; 0,29 U/mg lyophilisée) et de la DNase I (0,1 mg/mL) dans un milieu RPMI 1640 préparé (voir l’étape 1.1)
- À l’aide d’une pince, transférez la rate dans un tube C (tube de dissociation) contenant 3 ml de solution de digestion de la rate.
- Effectuez la dissociation mécanique à l'aide d'un homogénéisateur semi-automatisé selon les instructions du fabricant.
- Placez le tube C sur l’homogénéisateur semi-automatisé, en vous assurant que le tube C est bien placé sur le bras rotatif. Une fois le tube C placé, appuyez sur le bouton de démarrage de l’homogénéisateur semi-automatique pour exécuter le protocole Spleen 04.01 pour 60 s.
REMARQUE : La dissociation mécanique peut également être effectuée en plaçant un filtre de 40 μm sur un tube conique de 50 mL et en broyant doucement la rate à travers le filtre. Après avoir broyé la rate, rincez le filtre de 40 μm avec 10 mL de média RPMI.
- Après dissociation mécanique, détachez le tube de l’homogénéisateur et effectuez la digestion enzymatique. Incuber les échantillons pendant 15 min à 37 °C en rotation continue (20 tr/min).
- Transférez la solution en la pipetant dans un tube conique de 50 mL après l’avoir filtrée à travers une crépine de 40 μm. Lavez la crépine de 40 μm avec 10 ml de PBS de Dulbecco (dPBS). Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Après la centrifugation, aspirer complètement le surnageant et laver la pastille en la remettant en suspension dans 10 mL de dPBS. Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.
3. Isolement des DC CD11c+ à partir d’une suspension monocellulaire splénique
- Remettre la pastille cellulaire en suspension dans 5 mL de dPBS et compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et d’une exclusion au bleu de trypan.
- Granuler les cellules par centrifugation à 300 x g, pendant 10 min à 4 °C.
- Aspirez complètement le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 400 μL de tampon de tri cellulaire (MAC) activé magnétiquement.
- Ajouter 100 μL de microbilles CD11c (voir le tableau des matériaux) par 1 x 108 cellules.
- Vortex la suspension cellulaire et incuber pendant 10 min au réfrigérateur à 4 °C.
- Ajouter 10 ml de tampon MAC pour laver les cellules. Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Aspirer complètement le surnageant et le remettre en suspension dans 500 μL de tampon MAC.
4. Séparation magnétique des CD11c+ DC
REMARQUE : La séparation magnétique se fait manuellement à l’aide d’un séparateur magnétique (voir Tableau des Matériaux) équipé de colonnes LS. La séparation magnétique peut également être effectuée automatiquement à l’aide d’un séparateur magnétique automatisé. (voir Tableau des matériaux).
- Placez la colonne LS dans le champ magnétique du séparateur MAC et un tube conique de 15 mL sous chaque colonne pour recueillir l’écoulement.
- Rincez la colonne LS avec 3 ml de tampon.
- Placez la suspension cellulaire sur chaque colonne LS et recueillez le flux contenant les cellules non étiquetées.
- Lavez la colonne LS avec 3 mL de tampon MAC, en recueillant les cellules non marquées qui la traversent. Lavez la colonne LS 2 fois de plus.
- Retirez la colonne LS du séparateur magnétique. Ajoutez 5 ml de tampon MAC dans chaque colonne et rincez immédiatement les cellules marquées magnétiquement en plongeant fermement la colonne LS dans un tube conique propre de 15 ml.
note: Il est important d’effectuer un double isolement des cellules CD11c pour obtenir une suspension cellulaire de haute pureté. Par conséquent, répétez les étapes 3.1 à 4.5. et la figure 4 de référence pour les étalons de pureté. Cette étape améliore la pureté des cellules CD11c+ à 90-95 %.
- Déterminer le nombre de CD CD11c+ sur un hémocytomètre à l’aide de l’exclusion du bleu de trypan. Diluer l’échantillon cellulaire à une dilution de 1:1 dans une solution de bleu de trypan à 0,4 %.
REMARQUE : Les cellules non viables seront colorées en bleu, tandis que les cellules viables resteront non colorées.
- Pour ce faire, remplissez soigneusement un hémocytomètre avec 10 μL de dilution de l’échantillon cellulaire et incubez pendant 1 minute.
- Comptez les cellules dans 4 carrés de 1 x 1 mm2 dans la chambre qui a été chargée pour déterminer le nombre de cellules viables.
5. Traitement in vitro à haute teneur en sel des CD CD11c+
- Préparez le milieu de culture DC en ajoutant 10 % de FBS, 0,1 mM de HEPES, 1 mM de pyruvate de sodium, 50 μM de β-mercaptoéthanol et 1 % de pénicilline/streptomycine à 500 mL de 1640 RPMI.
- Préparez 10 milieux de culture cellulaire à haute teneur en sel (400 mM) en pesant 1,17 g de NaCl et en le plaçant dans un tube de faucon stérile de 50 mL. Ajouter 50 mL de milieu de culture cellulaire stérile à courant continu (préparé à l’étape 5.1) dans le tube de faucon de 50 mL et agiter jusqu’à ce que le NaCl soit en solution.
- Filtrez immédiatement le milieu de culture DC à haute teneur en sel à l’aide d’une filtration sous vide à travers un filtre de 0,2 μm dans une hotte de culture cellulaire.
- Centrifuger chaque suspension cellulaire de la rate à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Remettre en suspension chaque pastille cellulaire dans un milieu de culture à courant continu à une concentration de 1 x 106 cellules/mL.
- Pipette de 900 μL (environ 1 x 106 cellules) de la suspension DC dans une plaque Falcon à fond plat à 24 puits. Ajouter 100 μL de milieu de culture à haute teneur en sel DC dans chaque puits pour une concentration finale en sodium de 190 mM. Étiquetez la plaque et placez-la dans un incubateur de CO2 humifié à 37 °C pendant 48 h.
6. Transfert adoptif de CD CD11c+ traités à haute teneur en sel
- Après une stimulation in vitro de 48 h, retirer la plaque de l’incubateur de CO2 humifié à 37 °C.
- Pipetez le milieu de culture cellulaire vers le haut et vers le bas pour remettre en suspension les CD11c+ DC. Pipetez toute la suspension CD11c+ DC dans un tube de 1,6 mL étiqueté correspondant. Répétez cette étape pour chaque individu bien placé.
- Centrifuger chaque suspension CD11c+ DC à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Aspirer le surnageant. Remettez en suspension la pastille DC avec 100 μL de dPBS stérile.
- Tirez la suspension à courant continu dans une seringue de 1 mL équipée d’une aiguille de 27 G 1/2 pouce.
- Placez les souris mâles naïves C57bl/6 de 10 semaines sous 2 % d’isoflurane pour obtenir un plan chirurgical stable. Vérifiez le niveau d’anesthésie avec l’absence de réflexe de pédale. Une fois qu’un plan chirurgical stable est obtenu, introduisez lentement et soigneusement l’aiguille dans l’espace rétro-orbitaire à un angle d’environ 30°.
note: Le biseau de l’aiguille de 27 G doit être pointé vers le bas, loin de l’œil, pour éviter les lésions oculaires.
- Injectez lentement et en douceur la suspension CD11c+ DC (environ 1 x 106 cellules). Une fois l’injection terminée, retirez soigneusement l’aiguille de l’espace rétro-orbitaire en faisant attention à ne pas endommager l’œil.
note: Après l’injection, il devrait y avoir peu ou pas de saignement. Le transfert adoptif de CD CD11c+ peut également être effectué à l’aide d’une méthode d’injection IV (par exemple, veine de queue). Les souris témoins ont reçu des CD CD11c+ qui ont été cultivés dans des milieux salins normaux.
- Retirez les souris du cône nasal et surveillez-les pendant environ 30 minutes pendant la récupération de l’anesthésie.