Imagerie des cellules bêta transgéniques chez une souris immunodéficiente confrontée à des splénocytes diabétiques

Résumé

Source : Stewart, T. et al., Surveillance bioluminescente de la survie du greffon dans un modèle de transfert adoptif du diabète auto-immun chez la souris.J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo présente une méthode basée sur l’imagerie pour visualiser des cellules bêta transplantées exprimant la luciférase dans une souris immunodéficiente diabétique non obèse. L’introduction de splénocytes à partir d’une souris diabétique entraîne une destruction progressive des cellules bêta, confirmée visuellement par une diminution de la luminescence après l’introduction du substrat.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Ingénierie et maintenance des lignées cellulaires NIT-1

1. Maintenir les lignées cellulaires NIT-1, qui partagent un patrimoine génétique avec les souris diabétiques non obèses (NOD), et les cellules 293FT dans des boîtes traitées par culture tissulaire dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 4,5 g/L de glucose complété par 10 % de sérum de bovin fœtal et 1 % de pénicilline/streptomycine dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂.
2. Augmentez les cellules de 293FT à 70 %-80 % de confluence pour la transfection.
3. Pour une boîte de 10 cm de cellules de 293FT, combiner 10 μg de pLenti-luciférase-blast (voir le fichier supplémentaire 1), qui exprime le transgène luciférase de luciférase (luc2) sous le contrôle du promoteur EF1α constitutivement actif, 2 μg chacun des plasmides d’emballage pMD2.G, pMDLg/pRRE et pRSV-Rev, 4 μg du plasmide de protéine d’enveloppe pCMV-VSV-G, et 60 μg de polyéthylénimine linéaire (PEI) dans 1 mL de DMEM sans sérum. Ajustez les quantités en fonction du nombre de cellules à transfecter.
4. Laissez l’ADN, le PEI et le DMEM à température ambiante (RT) pendant 20 min, puis ajoutez-les aux cellules de 293FT.
5. Prélever le milieu contenant les particules lentivirales 48 h après la transfection.
6. Transduire, les cellules NIT-1 à ~80 % de confluence avec 1 mL de milieu contenant des particules lentivirales pour 10⁶ cellules pendant 48 à 72 h.
7. Sélectionnez les cellules exprimant la luciférase avec 5 μg/mL de blasticidine pendant 48 h.
8. De plus, modifiez génétiquement les cellules exprimant la luciférase pour les adapter à la question expérimentale. Incluez une lignée cellulaire témoin de type sauvage exprimant la luciférase ou non ciblée à des fins de comparaison.
   note: Des exemples de modifications génétiques cibles comprennent l’inactivation de courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées (CRISPR), l’inactivation de CRISPRa/i, l’inactivation de shRNA et la surexpression.

2. Préparation des cellules NIT-1 pour la transplantation

1. Cultivez les cellules exprimant la luciférase jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 80 % à 90 %.
2. Retirer le milieu de croissance et laver les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, 5 mL pour une parabole de 10 cm).
3. Ajouter 1 mL d’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique à 0,05 % (trypsine-EDTA) dans chaque plat pendant 2 min.
4. Neutralisez la trypsine avec 5 mL de milieu de croissance.
5. À l’aide d’une pipette, vous pouvez retirer les cellules de la parabole et les transférer dans un tube conique.
   note: Les cellules de plusieurs boîtes de la même lignée cellulaire peuvent être combinées.
6. Comptez les cellules à l’aide d’un colorant tel que le bleu trypan manuellement avec un hémocytomètre ou automatiquement avec un compteur de cellules automatique.
7. Centrifuger à 250 × g pendant 5 min à RT et prélever le surnageant à l’aide d’une pipette aspirante.
8. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans du PBS à une concentration de 5 × 10⁷ cellules/mL (10 7 cellules par lignée cellulaire et par souris seront transplantées dans un volume de 200 μL).
9. Conservez les cellules sur de la glace (jusqu’à 3 h) jusqu’à la transplantation.

3. Transplantation de cellules NIT-1 chez des souris non obèses atteintes d’immunodéficience combinée diabétique-sévère (NOD-scid)

1. Anesthésier les souris receveuses (souris NOD-scid de 8 à 10 semaines du même sexe que les souris utilisées pour isoler les splénocytes) par inhalation d’isoflurane dans une chambre de renversement. Délivrer 2,5 % d’isoflurane dans la chambre à un débit de 1,5 L/min et un taux d’évacuation de 9 L/min.
2. Lubrifiez les yeux de l'animal avec une pommade ophtalmique pour éviter le dessèchement.
3. À l’aide d’un rasoir électrique avec une protection, retirez les poils de l’arrière (côté dorsal) des souris pour exposer la peau. La zone de transplantation rasée sera d’environ 1 po x 2 po. Remettez les souris rasées dans la chambre d’abattage jusqu’à la greffe.
4. Transférez les souris une à la fois sur une surface propre avec un cône nasal d’isoflurane. Guidez doucement la tête de la souris dans le cône du nez. Utilisez un débit d’isoflurane de 0,25 L/min pour maintenir l’anesthésie pendant la greffe.
5. Essuyez la zone de transplantation avec un tampon de préparation à l’alcool isopropylique pour enlever les poils morts et désinfecter la peau.
6. Assurez-vous que les cellules sont complètement remises en suspension avant de charger la seringue. Prélevez un volume excédentaire (>300 μL) de cellules dans une seringue stérile de 1 mL à l’aide d’une aiguille de 26 G. Retirez toutes les bulles ; puis remettez les cellules excédentaires dans le tube de sorte que 300 μL de suspension cellulaire restent dans la seringue.
7. À l'aide d'une paire de pinces incurvées tenues dans la main non dominante, soulevez doucement la peau d'un côté (gauche ou droite) du dos de la souris pour permettre un accès plus facile à l'espace sous-cutané.
8. À l'aide de la main dominante, positionnez la seringue parallèlement aux plans coronal et sagittal du corps de la souris. Avec l’aiguille pointée vers la tête de la souris, insérez l’aiguille dans la peau près de l’arrière-train et guidez-la doucement dans l’espace sous-cutané. Assurez-vous que toute l’aiguille reste sous la peau et ne passe pas à travers.
9. Ajustez la pince pour maintenir doucement la peau autour de la base de l’aiguille. Distribuez lentement une petite quantité de suspension cellulaire (<50 μL) et confirmez qu’un petit renflement se forme sous la peau au site d’injection. Continuez à injecter la suspension cellulaire jusqu’à ce que 200 μL aient été délivrés dans l’espace sous-cutané.
10. En maintenant la pince en place et en gardant l'aiguille parallèle au corps de la souris, retirez lentement l'aiguille. Une fois l’aiguille retirée, maintenez la peau fermée avec une pince pendant quelques secondes pour éviter que les cellules ne s’échappent de la plaie perforante.
11. Si une modification génétique est en cours d’évaluation, répétez la greffe du côté opposé de la souris à l’aide d’une seringue différente afin que les cellules mutantes et de contrôle soient injectées dans chaque souris, avec une lignée cellulaire à gauche et l’autre à droite. Si une seule lignée cellulaire est transplantée, injectez les cellules d’un seul côté.
12. Après la greffe, transférez chaque souris dans une cage fraîche. Laissez chaque souris se remettre complètement de l’anesthésie avant d’ajouter des souris supplémentaires à la cage.
    note: Les souris se rétablissent lorsqu’elles reprennent leurs activités normales et ne montrent pas de signes de léthargie ou d’altération des mouvements.
13. Évaluez quotidiennement l’état de santé des souris pendant toute la durée de l’expérience suivant la greffe. Si les greffons forment un grand renflement ou si les souris deviennent faibles et léthargiques, mesurez leur glycémie et fournissez 10 % (p/p) d’eau de saccharose ad libitum à toutes les souris hypoglycémiques. Suivez toutes les recommandations vétérinaires et euthanasiez toutes les souris dont le corps est en mauvais état conformément aux directives de l’établissement. Dans cette étude, des souris ont été euthanasiées par inhalation de CO₂ suivie d’une luxation cervicale.

4. Isolement et purification des splénocytes autoréactifs

1. Identifiez les souris NOD mâles ou femelles âgées de 10 à 16 semaines atteintes d’un diabète récent (moins de 10 jours) à l’aide de bandelettes de test de glycémie dans l’urine (ou le sang). Les souris NOD sont considérées comme diabétiques lorsqu’elles ont une glycémie ≥250 mg/dL dans l’urine pendant au moins 2 jours consécutifs.
   note: Pour chaque souris NOD-scid, 10 millions de splénocytes sont nécessaires ; Une rate produit généralement 50 à 150 millions de splénocytes. Les splénocytes ont été isolés chez des souris exemptes d’agents pathogènes hébergées dans une installation surveillée par sentinal.
2. Euthanasier le nombre approprié de souris NOD diabétiques.
   note: Dans cette étude, les souris ont été euthanasiées par inhalation de CO₂ suivie d’une luxation cervicale pour assurer la mort.
3. Avec la souris sur le dos, faites une incision verticale d’environ 2 pouces de longueur dans la peau avec des ciseaux chirurgicaux. Ouvrez le côté droit de la souris du point de vue du chercheur et localisez la rate rouge vif. Coupez délicatement la rate du pancréas rose et transférez-la dans une boîte de Pétri stérile de 10 cm contenant 5 ml de PBS stérile. Répétez la dissection avec autant de souris que nécessaire.
   note: Les rates de plusieurs souris peuvent être combinées dans un seul plat. Effectuez les étapes suivantes à l’aide de réactifs et d’équipement stériles dans une hotte stérile.
4. Écrasez la rate avec le dessus plat d’un piston de seringue stérile.
5. Placez une passoire de 40 μm ou 70 μm dans un tube conique de 50 mL et lavez la passoire avec 5 mL de PBS pour l’amorcer. Transférez la suspension de rate dans la passoire et continuez à écraser doucement à travers la passoire. Lavez le plat avec 10 ml de PBS et transférez le lavage dans la passoire. Continuez à écraser jusqu’à ce que la couleur rouge ait disparu de la passoire.
6. Jeter la passoire et faire tourner le tube à 500 × g pendant 5 min à RT. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette aspirante.
7. Remettre la pastille cellulaire en suspension dans 5 ml (pour un maximum de trois rates) de tampon de lyse ACK préchauffé à la RT et lyser les globules rouges pendant 4 min. Augmenter le volume de 1 à 2 mL par rate si des rates supplémentaires sont nécessaires.
8. Arrêtez la réaction avec 5 mL de milieu cellulaire NIT-1 (décrit ci-dessus) par 5 mL de tampon de lyse. Passez la suspension cellulaire dans une passoire fraîche pour éliminer les grumeaux. Jetez la passoire et tournez à 500 × g pendant 5 min à RT.
9. Remettez la pastille de cellule en suspension dans 20 ml de PBS et comptez les cellules. Essorer à 500 × g pendant 5 min à RT. Remettre les cellules en suspension dans du PBS stérile à une concentration de 1 × 10⁸ cellules/mL (le volume d’injection est de 0,1 mL/souris) dans un tube de réaction de 1,5 mL.
10. Conservez les cellules sur de la glace (pendant pas plus de 1 h) ou conservez les cellules à RT, et procédez immédiatement à l’injection dans la veine de la queue.

5. Injection intraveineuse de splénocytes diabétiques via la veine latérale de la queue

1. Réchauffez le corps des souris adultes receveuses NOD-scid (par exemple, en utilisant une lampe chauffante pendant ~5-10 min) pour vasodiler les veines (cela aide à la visualisation et à l’injection dans la veine).
   note: Pour éviter la surchauffe des souris, ne dépassez pas ce temps. Surveillez toujours l’état de santé. Si les souris semblent épuisées ou immobiles, éteignez immédiatement la lampe chauffante.
2. Réchauffez la suspension cellulaire. Préparez une seringue stérile (0,3 à 1,0 ml) à l’aide d’une aiguille stérile (27 à 30 g, 0,3 mm/0,5 po ou moins), ou utilisez une seringue à insuline stérile de 0,5 mL à l’aide d’une aiguille de 0,3 mm (0,5 po). Gardez toujours l’aiguille stérile et utilisez un plateau stérile si la seringue doit être posée entre les injections.
3. Remettre en suspension la solution splénocytaire avant chaque injection. Pour chaque souris, aspirer 100 μL de la suspension de splénocytes préchauffée et mélangée dans la seringue. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la seringue ou dans la suspension.
   note: Assurez-vous d’avoir tout l’équipement et les fournitures préparés (lingettes imbibées d’alcool pour la désinfection, une seringue chargée des splénocytes à injecter et une cage neuve pour séparer les souris injectées) avant de placer la souris dans le dispositif de contention.
4. Placez la souris dans le dispositif de retenue. Capturez la queue avec la main non dominante et localisez l’une des deux nervures latérales de la queue. Faites pivoter doucement la queue si nécessaire. Essuyez la queue avec une lingette désinfectante (alcool isopropylique à 70 %) pour nettoyer la peau et augmenter la visibilité de la veine.
5. Insérez l’aiguille à un angle aigu dans la région centrale de la queue avec la main dominante. Avec le biseau de l’aiguille vers le haut, faites glisser l’aiguille sur quelques millimètres à travers la peau.
   note: Assurez-vous que l’aiguille est parallèle à la veine et placée légèrement sous la peau. Préparez-vous à des mouvements brusques de la souris ou de la queue directement après avoir pénétré la paroi de la peau ou des vaisseaux. Une insertion réussie de l’aiguille doit ressembler à une « glissade douce » dans la veine. Si une autre tentative est nécessaire, remontez la queue vers le corps.
6. Appliquez une légère pression sur la seringue pour injecter la suspension de splénocytes. Ne laissez pas l’aiguille se déplacer davantage vers l’intérieur ou vers l’extérieur lors de l’injection. Les injections réussies sont douces sans ressentir de contre-pression pendant l’injection et sont indiquées par un flux de sang transparent/blanc immédiatement après l’injection.
7. Relâchez doucement l’aiguille de la veine et appliquez une légère pression sur la queue avec une lingette désinfectante jusqu’à ce que le saignement cesse. Libérez la souris du dispositif de contention et transférez-la doucement dans une cage fraîchement préparée.
   note: Injectez des splénocytes à deux ou trois souris témoins qui ne reçoivent pas de greffe de cellules NIT-1 pour confirmer le potentiel des splénocytes autoréactifs à induire le diabète, ce qui prend environ 2 à 4 semaines après l’injection.

6. Imagerie bioluminescente in vivo des greffons NIT-1

REMARQUE : Imagez les greffons une à deux fois par semaine. Le jour de la greffe, attendez au moins 2 h après la greffe pour permettre aux greffons de se stabiliser et d’assurer une expression stable de la luciférase. Si le temps est un facteur limitant, la mesure initiale peut être prise le jour 1 à la place. Un calendrier d’imagerie initial recommandé est le jour 0 ou le jour 1 après l’injection, le jour 5, le jour 10, le jour 14, le jour 18 et le jour 25. Ajustez toutefois le calendrier en fonction de la progression de l’auto-immunité, jugée par la perte de signal bioluminescent.

1. Préparez une solution de D-luciférine à 15 mg/mL dans le PBS de Dulbecco. Agiter à RT pour dissoudre, et filtre stérile (0,22 μm). Conserver 1 mL d’aliquotes à −20 °C et décongeler au besoin.
   note: Les aliquotes peuvent être recongelées.
2. Au moins 5 minutes avant l’imagerie, injecter les souris par voie intrapéritonéale à l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une aiguille de 26 G avec une solution de D-luciférine à une dose de 150 mg/kg.
   note: Utilisez une seringue et une aiguille neuves pour chaque souris.
3. Anesthésier les souris par inhalation d’isoflurane selon les directives de l’établissement. Les conditions recommandées sont 2,5 % d’isoflurane avec un débit de 1,5 L/min dans la chambre de démontage et un taux d’évacuation de 9 L/min.
4. Lubrifiez les yeux de l'animal avec une pommade ophtalmique pour éviter le dessèchement.
5. Ouvrez le logiciel associé à l’instrument d’imagerie. Créez un nouvel utilisateur et/ou un nouvel identifiant. Sur le panneau de configuration en bas à droite, sélectionnez Initialiser (Figure 1A). Pour enregistrer automatiquement les données d’imagerie, créez les dossiers appropriés sur l’ordinateur, puis sélectionnez Acquisition | Enregistrement automatique dans... (Figure 1A). Une fois l’initialisation de l’instrument terminée, réglez le temps d’exposition sur 1 min.
   note: Les paramètres d’imagerie complets sont illustrés à la figure 1B.
6. Transférez les souris une à la fois de la chambre de renversement à l’instrument d’imagerie. Placez la souris sur le ventre avec ses membres écartés et guidez doucement sa tête dans le cône nasal. Un débit d’isoflurane de 0,25 L/min délivré par un cône nasal est approprié pour maintenir l’anesthésie pendant l’imagerie. Aplatissez doucement la souris en appuyant sur le centre de son dos avec les deux mains, puis en écartant les mains vers l’extérieur et les unes pour les autres.
7. Sélectionnez Acquérir (Figure 1B). Enregistrez tous les détails pertinents de l’expérience dans la fenêtre contextuelle (Figure 1C).
   note: Voir la figure 2A pour des images représentatives de trois souris femelles NOD-scid âgées de 8 semaines transplantées avec deux greffons à différents moments.

Résultats

Figure 1 : Captures d’écran des commandes logicielles pour l’imagerie des greffons bioluminescents. (A) Avant l’imagerie, sélectionnez Initialiser pour préparer l’instrument. Les images peuvent être enregistrées automatiquement dans le dossier de votre choix en sélectionnant Acquisition | Enregistrement automatique dans... (

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,05 % de trypsine, 0,53 mM d’EDTA	Corning	Référence 25-052-CI
293 PIEDS	Invitrogen	Réf. R70007	Isolat clonal à croissance rapide, hautement transfectable, dérivé de cellules rénales embryonnaires humaines transformé avec le grand antigène T SV40
Tampon de lysage ACK	Gibco	Référence A10492-01
Tampons de préparation à l’alcool, 70 % d’alcool isopropylique	Amazon/Premiers secours toujours prêts	B08NWF31DX
BD 5ml Seringue Luer-Lok Tip	Bd	309646
Aiguille BD PrecisionGlide 26G x 5/8 (0,45 mm x 16 mm) Sub-Q	Bd	305115
BD 1 mL TB Embout de seringue	Bd	309659
Blasticidine S HCl	Corning	30-100-RB
Filtre à cellules premium SureStrain, 70 μm, stérile	Matériel de laboratoire du Sud	Réf. C4070	Ou utilisez une passoire stérile similaire avec une taille de pores de 40 à 70 um
Compteur automatisé de cellules CellDrop	Denovix	CellDrop BF-PAYG	Ou utilisez un dispositif de comptage de cellules similaire
Corning 100 mL de pénicilline-streptomycine en solution, 100x	Corning	30-002-CI
Pipettes aspirantes jetables, polystyrène, stériles, capacité = 2 mL	VWR	Référence 414004-265	Ou utilisez une pipette d’aspiration similaire
D-luciférine, sel de potassium, qualité biologie moléculaire, poudre, >99 %	Goldbio	CHANCE-100
DMEM, glycémie élevée, pyruvate, sans glutamine	Gibco	10313039
Tubes Falcon BD, 50 mL	Fisher Scientific	Référence 14-959-49A
Sérum fœtal bovin	Gibco	Référence 10437-028
Pince premium pour mouchoirs, 1 x 2 dents 5 po, acier allemand	Fisher Scientific	Tél. : 13-820-074
Bandelette de test d’urine de glucose	Pharmacie pour animaux de compagnie en Californie	U-TSG100	Ou utilisez une bandelette de test similaire pour mesurer le glucose dans l’urine / le sang
GlutaMAX–1 (100x)	Gibco	Référence 35050-061
Lampe chauffante infrarouge	Cole Parmer	Référence 03057-00	Ou utilisez une lampe infrarouge similaire
Seringue à insuline 0,5 mL, U-100 29 G 0,5 po	Becton Dickinson	309306
Isoflurane, USP	Soins intensifs Piramal	6679401725
Système d’imagerie in vivo IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	Instrument de collecte non invasive d’images bioluminescentes de cellules transplantées
Logiciel d’analyse d’images vivantes	Perkin Elmer	128113	Logiciel de collecte et de quantification d’un signal bioluminescent
Microtubes à centrifuger seal-rite, 1,5 mL	Scientifique américain	Référence 1615-5510	Ou utilisez des microtubes à centrifuger stériles similaires
NIT-1	ATCC	CRL-2055	Lignée bêta-cellulaire pancréatique dérivée de souris NOD/Lt
hocher. cg-prkdcscid/j	Le Laboratoire Jackson	N° 1303	Les souris homozygotes pour la mutation spontanée de l’immunodéficience combinée sévère Prkdcscid, communément appelée scid, sont caractérisées par une absence de cellules T et B fonctionnelles, une lymphopénie, une hypogammaglobulinémie et un microenvironnement hématopoïétique normal.
NOD/ShiLtJ	Le Laboratoire Jackson	1976	La souche de souris NOD/ShiLtJ (communément appelée NOD) est un modèle polygénique de diabète auto-immun de type 1
PBS, pH 7,4	Thermo Fisher Scientific	10010031	Sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénol
pCMV-VSV-G	Addgene	Référence 8454
Explosion de plenti-luciférase	Fabriqué en interne	Plasmide disponible sur demande	Voir le dossier supplémentaire 1
pMD2.G	Addgene	Référence 12259
pMDLg/pRRE	Addgene	Référence 12251
Polyéthylénimine, linéaire, MW 25 000, qualité transfection (PEI 25K)	Fisher Scientific	NC1014320
pRSV-Rev	Addgene	Référence 12253
Dispositif de contention pour rongeurs, style brome rond 1 po	Fisher Scientific	Référence 01-288-32A
Ciseaux, pointus	Fisher Scientific	Référence 08-940	Ou utilisez d’autres ciseaux en acier inoxydable de qualité chirurgicale
Boîtes de culture traitées pour culture tissulaire	Millipore Sigma	CLS430167-20EA	Ou utilisez d’autres boîtes de Pétri stériles traitées par culture cellulaire
Pince à épiler/pince, fine précision à pointe moyenne	Fisher Scientific	Référence 12-000-157