Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Matériaux et réactifs
- Utilisez des moustiques femelles Anopheles stephensi (souche Sda500) qui se nourrissent de souris infectées 3 à 5 jours après l’émergence et se reproduisent comme décrit précédemment.
- Utiliser des parasites clone de Plasmodium berghei ANKA exprimant le gène Green Fluorescent Protein (GFP) sous le contrôle du promoteur constitutif de la Heat Shock Protein 70 (HSP70). Cela produit une fluorescence brillante tout au long du cycle de vie du parasite.
- Utilisez des souris C57BL/6JRj femelles (âgées de 7 semaines).
note: Tous les réactifs utilisés dans le protocole décrit sont répertoriés dans la sectionMatériaux/Équipements.
2. Isolement de sporozoïtes atténués par rayonnement à partir des glandes salivaires des moustiques
- Entre 18 et 25 jours après le repas de sang infectieux, recueillir et anesthésier les moustiques dans un tube de 15 ml sur de la glace comme décrit précédemment. Transférez-les délicatement sur une boîte de Pétri en inversant le tube. Maintenez les insectes sur de la glace et exposez-les à une dose de 12 krad d’irradiation γ ou x.
- Isolez les sporozoïtes atténués des glandes salivaires de moustiques irradiées, comme décrit précédemment. Prélevez les glandes salivaires infectées dans un petit volume (environ 15 μl) de 1 solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) sur de la glace et écrasez-les doucement pour libérer des sporozoïtes.
note: L’injection d’une suspension parasitaire hautement concentrée dans un petit volume étant critique, il est donc essentiel de récolter un nombre suffisant de glandes salivaires à partir d’un grand nombre de moustiques bien infectés présélectionnés, comme en témoigne leur forte expression de fluorescence verte.
- Filtrer la suspension de sporozoïtes à travers un capuchon de crépine de 35 μm adapté à un tube de microcentrifugation à faible adhérence de 1,5 ml afin d’éliminer les amas et les débris de moustiques.
- Comptez le nombre total de sporozoïtes isolés comme décrit précédemment et ajustez la concentration de la suspension parasitaire avec 1x DPBS froid pour obtenir 83 000 sporozoïtes/μl. Stockez les parasites sur de la glace tout en continuant les étapes suivantes.
- Prélever le nombre équivalent de glandes salivaires de moustiques non infectés qui seront utilisés comme témoin négatif et traiter l’échantillon comme décrit aux étapes 2.2 et 2.3. Diluer l’échantillon comme indiqué ci-dessus pour obtenir une concentration similaire d’extraits de glandes salivaires dans la suspension.
note: Les sporozoïtes peuvent être conservés sur de la glace pendant un maximum de 2 heures. Cependant, idéalement, ils sont injectés dans l’heure qui suit l’écrasement des glandes salivaires.
3. Injection de sporozoïtes dans la couche dermique de l’oreille
- Anesthésier les animaux par injection intrapéritonéale d’un mélange de kétamine (50 mg/kg) et de xylazine (5 mg/kg). Attendez 5 à 8 minutes que la souris soit dans un état d’inconscience et appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour éviter le dessèchement de la cornée. Évaluez la profondeur de l’anesthésie en effectuant un léger pincement des orteils sur les deux pieds arrière.
note: La dose d’anesthésie dure moins de 20 minutes, les prochaines étapes doivent donc être effectuées rapidement.
- Stabilisez le pavillon de l’oreille de la souris en fixant la face ventrale à l’aide d’un ruban adhésif transparent préalablement placé sous un stéréomicroscope (Figure 1A). Appuyez doucement sur l’oreille pour éviter d’endommager le système vasculaire.
- Chargez une seringue de 10 μl/aiguille biseautée de calibre 35 avec 0,6 μl de parasites en suspension.
- Administrer la suspension de sporozoïte dans 4 sites d’injection (0,15 μl par site) en insérant soigneusement l’aiguille sur la face dorsale de l’oreille (Figure 1A), sous l’épiderme, avec le biseau vers le haut, en prenant soin d’éviter tout vaisseau sanguin. Laissez l’aiguille rester dans le derme pendant quelques secondes pour éviter le reflux de l’injecteur avant de le retirer. Observer une papule caractéristique à chaque site d’injection à la fin de l’intervention (Figure 1B et 1C).
- Après l’injection, retirez délicatement l’oreille du ruban.
- Injectez à l’oreille controlatérale la même dose de parasites en suivant les étapes 3.2-3.4.
- Injectez à 2 souris supplémentaires soit 0,6 μl de 1x DPBS soit 0,6 μl de 1x DPBS + extrait de glandes salivaires de moustiques non infectés afin d’évaluer la réponse inflammatoire médiée par l’injection seule et le dépôt de matériel de moustique dans le derme.
- Surveillez la récupération de la souris après l’anesthésie avant de la remettre dans la cage.
note: Le dépôt correct de sporozoïtes dans la peau peut être surveillé par microscopie à fluorescence (figures 2A et 2B), la souris étant préparée comme décrit précédemment.
