1. Culture d’iPSC humaines (hiPSC) sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF)
REMARQUE : D’autres méthodes de culture des hiPSC peuvent également être utilisées, y compris, mais sans s’y limiter, l’ensemencement sur une plaque à 6 puits pré-enrobée de gélatine, d’un mélange de protéines gélatineuses, de laminine recombinante 511 ou de toute autre matrice extracellulaire utilisée dans l’expansion des hiPSC, et cultivée à l’aide de milieux définis spécialement formulés pour la culture de cellules souches pluripotentes humaines.
- Culture MEF
- Enduire une boîte de Pétri de culture cellulaire de 10 cm avec 4 ml de gélatine à 0,1 % et incuber pendant 30 min à 37 °C.
- Décongelez rapidement un flacon de 4 x 10 6 MEF irradiés dans 10 mL de milieu MEF à 37 °C (milieu Eagle modifié de Dulbecco [DMEM] + 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) + 1 x pénicilline-streptomycine + 1 x supplément de L-glutamine). Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 9 mL de milieu MEF.
- Retirez le plat recouvert de gélatine de l’incubateur. Aspirez la gélatine et ajoutez 7 ml de média MEF. Déposer 3 mL de suspension MEF (à partir de l’étape 1.1.2) sur le plat recouvert de gélatine. Basculez le plat d’un côté à l’autre et d’avant en arrière pour assurer une répartition uniforme du MEF sur le plat. Incuber à 37 °C pendant 8 à 36 h.
- Passage de hiPSC sur MEF
REMARQUE : Les données ont été générées à l’aide de l’antigène de mélanome reconnu par les cellules T 1 (MART-1) iPSC dérivé d’un lymphocyte infiltrant la tumeur du mélanome en culture à long terme (TIL), qui reconnaît spécifiquement le peptide MART-1 dans le contexte de l’antigène leucocytaire humain (HLA)-A*02:01.
- Passage des hiPSC lorsque les colonies ont un diamètre compris entre 0,8 et 1,2 mm. Avant le passage, vérifiez les colonies de hiPSC au microscope stéréoscopique et retirez toutes les zones de différenciation de la culture à l’aide du bord en plastique d’une pointe de 200 μL.
- Aspirez le milieu usagé et ajoutez-y 10 mL de milieu hiPSC (milieu de culture de cellules souches embryonnaires humaines [ES] + 10 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes de base humain [hbFGF]) complété par un inhibiteur de la protéine kinase associée à Rho (ROCK) de 10 μM.
- Tenez la boîte de culture cellulaire dans une main et faites rouler un outil de passage cellulaire jetable sur toute la boîte dans une direction. Appliquez une pression suffisante pour que toute la lame du roller touche la boîte de culture et maintienne une pression uniforme pendant l’action de roulement.
- Faites pivoter la boîte de culture à 90° et répétez l’étape 1.2.3. Visualisez la plaque au microscope pour confirmer visuellement la bonne coupe des colonies, qui doivent apparaître en damier. Détachez les colonies coupées par rinçage mécanique doux à l’aide d’une pipette de 200 μL.
note: Le détachement des colonies coupées par rinçage mécanique doit être effectué immédiatement après la coupe des colonies avec le rouleau car après 3 min, les colonies coupées commenceront à se rattacher à la boîte et il deviendra difficile de détacher des colonies de taille homogène par rinçage.
- Transvaser 350 à 600 touffes de colonies coupées dans une nouvelle boîte de 10 cm de MEF (plaquée 8 à 36 h avant le passage des hiPSC) avec 10 mL de milieu hiPSC frais complété par un inhibiteur de ROCK de 10 μM. Incuber à 37 °C
REMARQUE : 600 amas représentent environ 1,0 x 106 MART-1 iPSC et donneront 0,5-1,0 x 106 cellules DP le 35e jour. Cependant, les nombres attendus varieront en fonction de la puissance de la lignée cellulaire de départ et des conditions de culture.
- Le lendemain, aspirez le milieu usagé et ajoutez 10 ml de milieu hiPSC frais. Changez le milieu hiPSC tous les 1 à 2 jours, en fonction du taux de croissance des hiPSC.
2. Préparation de cellules OP9/DLL1 pour la co-culture avec des hiPSC
- Cultiver des cellules OP9/DLL1 dans un milieu OP9 [milieu essentiel α-minimum (α-MEM) + 20 % de sérum fœtal bovin (FBS) + 1x pénicilline-streptomycine] à 37 °C. Lorsque les cellules OP9/DLL1 atteignent la confluence, aspirez le milieu et lavez-les une fois avec 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans magnésium, calcium et rouge de phénol.
- Aspirer le PBS et ajouter 2 ml d’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,05 %. Incuber pendant 5 min à 37 °C. Ensuite, ajoutez 4 mL de milieu OP9 et dissociez mécaniquement la couche cellulaire par pipetage pour obtenir une suspension unicellulaire.
- Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 mL à travers une crépine de 100 μm pour éviter l’agglutination des cellules. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirer le surnageant et le remettre en suspension dans 12 mL de milieu OP9.
- Ajouter 8 mL de milieu OP9 dans six nouvelles boîtes de Pétri de culture cellulaire de 10 cm. Déposer 2 mL de suspension de cellules OP9/DLL1 à partir de l’étape 2.3 sur chaque nouvelle parabole de 10 cm. Basculez l’antenne d’un côté à l’autre, puis d’avant en arrière pour assurer une répartition uniforme de l’OP9/DLL1 sur l’antenne.
- Incuber à 37 °C. Répéter le passage tous les 2 à 3 jours lorsque les cellules atteignent la confluence.
note: Il est important de produire suffisamment de cellules OP9/DLL1 congelées et de décongeler une nouvelle pellicule toutes les 4 à 6 semaines.
3. Différenciation in vitro des hiPSC en lymphocytes T CD8αβ+ Single Positive (SP)
- Préparez des plats OP9/DLL1 gélatinisés une semaine avant la co-culture avec des hiPSC. Pour préparer une solution de gélatine à 0,1 %, ajoutez 5 mL de solution mère de gélatine de qualité tissulaire à température ambiante (RT) à 500 mL de PBS.
- Enduire 3 nouvelles boîtes de Pétri de culture cellulaire de 10 cm en ajoutant 4 ml par boîte de gélatine à 0,1 %. Incuber 30 min à 37 °C.
- Aspirez la gélatine et ajoutez 8 ml de média OP9 dans chaque plat. Passage d’une boîte confluente d’OP9/DLL1 (comme fait dans la section 2 ci-dessus) à trois boîtes pré-enrobées de gélatine.
- Après 4 jours, ajouter 10 ml de média OP9 dans chaque boîte de 10 cm de PO9/DLL1 sur de la gélatine pour 20 ml de média par plat.
- Après 7 à 8 jours, commencer la co-culture hiPSC sur des boîtes confluentes OP9/DLL1 (jour de différenciation 0).
- Aspirer le milieu usé d’une parabole confluente de 10 cm de hiPSC sur MEF. Ajouter 10 ml de support OP9. Coupez et détachez les colonies de hiPSC à l’aide d’un outil de passage de cellules jetable, comme indiqué aux étapes 1.2.3 et 1.2.4.
- Transvasez 350 à 600 touffes de colonies coupées dans une boîte OP9/DLL1 pré-gélatinisée de 10 cm (étape 3.1) avec 10 ml de milieu OP9 frais à l’aide d’une pipette de 200 μL. Secouez la parabole de culture d’un côté à l’autre, puis d’avant en arrière pour assurer une répartition uniforme des colonies.
note: Alternativement, des corps embryoïdes hiPSC (EB) préformés ou une suspension de petits amas peuvent être utilisés. Cependant, l’utilisation d’un outil de passage cellulaire jetable ou d’un système de formation d’EB est préférable pour produire des amas de hiPSC de taille uniforme.
- Le jour 1, aspirer le milieu épuisé et le remplacer par 20 mL de milieu OP9 frais. Les amas de hiPSC co-cultivés sur OP9/DLL1 pendant 1 jour se présentent sous la forme de petites colonies monocouches rondes (figure 1).
- Le jour 5, aspirez 10 ml de milieu usagé et ajoutez 10 ml de milieu OP9 frais. Les colonies de hiPSC commenceront à se différencier en mésoderme primitif, caractérisé par un centre sombre multicouche.
- Le 9e jour, aspirez 10 ml de support usagé et ajoutez 10 ml de support OP9 frais. À ce stade, les structures centrales multicouches évolueront en formes de dôme, et une zone périphérique semblable à un réseau deviendra évidente.
- Le 13e jour, les cellules progénitrices hématopoïétiques (HPC) de la récolte (Figure 1). Les structures dérivées des hiPSC le 13e jour sont caractérisées par un organoïde central sombre entouré d’un réseau de zones en forme de dôme, représentatives des zones hématopoïétiques (HZ) précédemment signalées comme renfermant des progéniteurs hématopoïétiques dérivés de cellules souches embryonnaires humaines.
REMARQUE : La présence de structures en forme de dôme indique un processus réussi même en l’absence de centres sombres. L’incapacité de produire des HPC peut être due à la mauvaise qualité de OP9/DLL1, à la qualité du lot FBS, à la confluence de touffes d’iPSC ensemencées sur OP9/DLL1 (350 à 600 touffes est optimale) et/ou à des variations de l’activité des lignées d’iPSC pour produire des précurseurs hématopoïétiques.
- Aspirer le milieu usagé et laver 1 fois avec 5 ml de solution saline équilibrée de Hanks sans rouge de phénol modifiée avec du calcium et du magnésium (HBSS).
- Aspirer HBSS et ajouter 250 μL de 5000 unités/mL de collagénase IV dans 10 mL de HBSS. Incuber à 37 °C pendant 45 min. Aspirez HBSS avec de la collagénase IV et lavez-le une fois avec 5 mL de PBS.
- Aspirez le PBS et ajoutez 5 ml de trypsine-EDTA à 0,25 %. Incuber à 37 °C pendant 20 min. Ensuite, ajoutez 4 mL de milieu OP9 et dissociez la couche cellulaire par pipetage pour obtenir une suspension unicellulaire.
- Transvaser la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 mL à travers une crépine de 100 μm. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirer le surnageant et le remettre en suspension dans 10 mL de milieu OP9.
- Déposer la suspension cellulaire sur une nouvelle boîte de Pétri de culture cellulaire gélatinisée de 10 cm (voir étapes 3.1.1 et 3.1.2). Incuber à 37 °C pendant 45 min. Ensuite, prélevez les cellules non adhérentes par pipetage doux.
- Transférez la suspension cellulaire recueillie dans un tube conique de 50 mL à travers une crépine de 100 μm. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirer le surnageant et le remettre en suspension dans 10 mL de milieu de différenciation [milieu OP9 avec 5 ng/mL de facteur de cellules souches humaines (hSCF), 5 ng/mL de ligand humain Flt3 (hFLT3L) et 5 ng/mL d’interleukine humaine 7 (hIL-7)].
- Placez la suspension cellulaire sur une nouvelle parabole confluente OP9/DLL1 de 10 cm.
- Au jour 16, passez les cellules.
- Détachez mécaniquement les cellules non adhérentes par pipetage doux et filtrez-les à travers une crépine de cellules de 100 μm. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirer le surnageant et le remettre en suspension dans un milieu de différenciation de 10 mL.
- Placez la suspension cellulaire sur une nouvelle parabole confluente OP9/DLL1 de 10 cm.
- Continuez à passer les cellules non adhérentes tous les 5 à 7 jours par la suite en répétant l’étape 3.8.
- Au 35e jour, enrichir la population de CD4+CD8+ double positif (DP) et stimuler la production de lymphocytes T CD8αβ+ simple positif (SP) (Figure 2).
- Détachez mécaniquement les cellules non adhérentes en les pipetant doucement et en les filtrant à travers une crépine de cellules de 100 μm pour éliminer les amas Enrichir la population de cellules CD4+ par l'isolement des billes magnétiques CD4 selon le protocole du fabricant.
note: La raison d’être de l’utilisation de billes magnétiques CD4 est d’éliminer les cellules CD4-CD8- double négative (DN) de la culture, car il a été démontré que celles-ci provoquent la destruction directe des cellules CD4+CD8+ DP après stimulation.
- Comptez les cellules vivantes enrichies en CD4 à l’aide d’un hémocytomètre Neubauer et d’un colorant bleu Trypan. Mettre en suspension dans un milieu OP9 à une concentration totale de 0,5 x 106 cellules/mL. Aliquote 1 mL de suspension cellulaire (0,5 x 106 cellules) dans chaque puits d’une culture tissulaire à fond plat de 24 plaques saines de confluent OP9/DLL1.
- Ajouter 100 UI d’interleukine humaine 2 (hIL-2), 5 ng/mL d’hIL-7, 500 ng/mL d’anticorps CD3 humains et 2 μg/mL d’anticorps CD28 humains, puis cultiver à 37 °C.
