Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Préparation des plats d’alimentation de cellules gliales (2 semaines avant la journée de culture)
- Disséquez le cortex du cerveau d’une souris postnatale âgée d’un jour et décollez les méninges.
- Hachez le tissu du cortex aussi finement que possible avec des ciseaux propres dans une boîte de Pétri propre sur un banc propre.
- Transférez le tissu haché dans 12 mL de HBSS et ajoutez 1,5 mL de trypsine à 2,5 % et de DNase à 1 % (en poids/vol). Incuber au bain-marie à 37 °C pendant 15 min, balancer toutes les 5 min. Les tissus bien digérés deviennent collants et forment une grande grappe. Triturez 10 à 15 fois avec une pipette de 10 ml pour décomposer le tissu et obtenir une meilleure digestion.
- Triturez le tissu bien digéré 10 à 15 fois avec une pipette de 5 ml jusqu’à ce que la plupart des morceaux disparaissent et que le milieu devienne trouble. Passez à travers une passoire cellulaire pour retirer les morceaux restants et ajoutez 15 ml de milieu glial (milieu essentiel minimal (MEM) complété par du glucose (0,6 % en poids/vol), du sérum de cheval à 10 % (vol/vol) et de la pénicilline-streptomycine (1x) pour arrêter la digestion.
- Centrifugez les cellules à 120 x g pendant 5 minutes et aspirez le surnageant. Remettre en suspension la pastille cellulaire avec un milieu glial frais et la graine dans des boîtes de culture cellulaire (environ 105 cellules/cm2).
- Remplacez le milieu par un milieu glial frais le lendemain pour éliminer les cellules non attachées.
- Nourrissez les plats gliaux tous les 3-4 jours avec du milieu glial frais. Frappez le flacon 5 à 10 fois avec la main pour déloger les cellules mal attachées avant de changer de milieu.
- Après 10 jours de culture, les cellules gliales devraient être presque confluentes. Détachez les cellules gliales avec 0,25 % de trypsine-EDTA et ensemencez environ 10à 5 cellules dans une nouvelle boîte de culture cellulaire de 60 mm. Les cellules restantes pourraient être congelées pour une utilisation future.
- 3 jours avant la journée de culture, changez le milieu glial en milieu de culture neuronale (milieu Neurobasal-A avec 1x GlutaMAX-I et 1x supplément de B27)
2. Culture des neurones de l’hippocampe
REMARQUE : Toutes les étapes sont effectuées à température ambiante.
- Disséquez 6 à 8 hippocampes de chiots postnatals âgés de 1 jour de souris ANK3-E22/23f/f avec un milieu HBSS dans une boîte de Pétri à température ambiante. Hachez l’hippocampe avec des ciseaux de dissection en petits morceaux. Transférez l’hippocampe de la boîte de Pétri dans un tube de 15 ml.
- Lavez l’hippocampe 2 fois avec 5 ml de HBSS dans le tube. Laissez l’hippocampe dans 4,5 mL de 1x HBSS après le lavage.
- Ajouter 0,5 mL de trypsine à 2,5 % dans 4,5 mL de HBSS et incuber dans un bain-marie à 37 °C pendant 15 minutes. Retournez le tube toutes les 5 minutes. L’hippocampe bien digéré doit devenir collant et former une grappe. Si nécessaire, prolongez la digestion pendant 5 minutes supplémentaires.
- Lavez l’hippocampe avec HBSS 3 fois pendant 5 minutes chacune. N’utilisez pas d’aspirateur pour retirer le HBSS. Il est très facile d’enlever l’hippocampe.
- Ajouter 2 ml de HBSS après le lavage et pipeter l’hippocampe de haut en bas avec une pipette Pasteur 15 fois.
- Triturez le tissu à l’aide d’une pipette Pasteur polie au feu (le diamètre de l’ouverture est rétréci de moitié) 10 fois. N’allez pas au-delà de 10 fois même s’il reste encore des morceaux. Le cisaillement excessif tue les neurones.
- Laissez reposer le tube pendant 5 minutes jusqu’à ce que tous les morceaux soient au fond. À l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL, transférez délicatement le surnageant contenant les neurones dissociés dans des plats de placage (10 boîtes de5 cellules/60 mm). Ajoutez-le directement dans le milieu de placage préincubé et secouez doucement l’assiette.
- Répétez les étapes 2.6-2.7 avec les morceaux restants jusqu’à ce que la plupart des morceaux aient disparu.
- 2 à 4 heures après l’ensemencement, vérifiez les plats de placage au microscope optique. La majorité des neurones auraient dû être attachés à la lamelle. Les cellules attachées sont rondes et lumineuses. À l’aide d’une pince à pointe fine, retournez les lamelles sur les boîtes d’alimentation de cellules gliales avec un milieu de culture neuronal préconditionné, avec les points de cire vers le bas.
- Les neurones peuvent se développer dans les boîtes nourricières de cellules gliales jusqu’à 1 mois. Nourrissez les neurones tous les 7 jours avec 1 mL de milieu de culture neuronal frais.
- Étape facultative : 1 semaine après l’ensemencement, ajouter la cytosine arabinoside (1-β-D-arabinofuranosylcytosine) à une concentration finale de 5 μM pour freiner la prolifération gliale.
