Génération d’une culture de neurones primaires de faible densité à partir de neurones embryonnaires congelés

Résumé

Source : Koganezawa, N. et al., Culture primaire à faible densité facile et reproductible à l’aide de stocks congelés de neurones embryonnaires de l’hippocampe.J. Vis. Exp. (2023)

Cette vidéo montre la méthode de culture de neurones embryonnaires cryoconservés, impliquant une décongélation contrôlée, une dilution avec un milieu neurobasal et un ensemencement sur une plaque recouverte de poly-L-lysine. L’incubation ultérieure favorise la croissance et le maintien des connexions neuronales.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Revêtement des plaques

1. Enduire une microplaque de 96 puits de poly-L-lysine (1 mg/mL, diluée dans un tampon de borate 0,1 M [pH : 8,5] ; 100 μL/puits) et incuber toute la nuit à 37 °C
   note: Ne recouvrez que les puits qui doivent être utilisés. Dans les expériences réalisées ici, les 60 puits du milieu sont utilisés. Le tampon de borate est préparé en mélangeant 50 mM d’acide borique et 12 mM de borate dans de l’eau stérilisée.
2. Lavez la plaque deux fois avec de l’eau stérilisée (250 μL/puits).
3. Lavez la plaque une fois avec un milieu de culture frais sans suppléments (250 μL/puits).
4. Faites sécher la plaque sur un banc propre pendant 20 min.
5. Enveloppez la plaque de papier d’aluminium et maintenez-la à 4 °C jusqu’à utilisation (valable 1 mois).

2. Ensemencement cellulaire

1. Ajouter 50 μL/puits de milieu de culture dans la plaque revêtue et le conserver dans un incubateur à 37 °C à 5 % de CO₂ pendant 30 min à 1 h. Remplir les puits périphériques avec de l’eau stérilisée (200 μL/puits).
   note: Le milieu de culture est préparé en ajoutant 50 fois plus de B-27, 400 fois de Glutamax et 100 U/mL de pénicilline/streptomycine dans le milieu neurobasal (voir le tableau des matériaux pour plus de détails).
2. Retirez le cryoflacon neuronal du réservoir d’azote liquide. Les neurones utilisés ici étaient des neurones cryoconservés au diméthylsulfoxyde (DMSO).
3. Immergez le cryoflacon dans un bloc thermique à 37 °C jusqu’à 3 min et décongelez partiellement le contenu. Ne réchauffez pas le cryoflacon trop longtemps. Transférez le contenu dans un tube de 50 ml dès qu’il est décongelé.
4. Transférez lentement le contenu du cryoflacon neuronal dans un tube stérile de 50 mL dans le sens de la goutte à goutte (50 μL/s) à l’aide d’une pipette de 1 mL avec un embout à pores larges.
5. Rincer le cryoflacon vide avec 1 mL de milieu de culture (température ambiante ; RT). Transférez ce 1 mL de milieu de culture du cryoflacon goutte à goutte (50 μL/s) dans le tube de 50 mL contenant la suspension cellulaire.
6. Ajouter 9 mL du milieu de culture (RT) dans le tube de 50 mL dans le sens goutte à goutte (0,5 mL/s) et augmenter le volume à 11 mL. Ne répétez pas le pipetage, mais mélangez lentement la suspension cellulaire.
7. Comptez le numéro de cellule (à l’aide d’un compteur de cellules ou d’un hémocytomètre).
8. Transférez toute la suspension cellulaire dans un réservoir et distribuez la suspension cellulaire dans la plaque de 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux avec des pointes à^pores larges (1,0 x 10 4 cellules/puits). Pour réduire l’évaporation du milieu de culture, remplissez les puits périphériques avec de l’eau stérilisée (étape 2.1).
   note: Cette étude confirme que l’évaporation du milieu de culture est faible pour une culture de 3 semaines sans échange de milieu. Le taux de réduction du milieu est de 3,6 % (n = 120 puits). Ainsi, le changement d’osmolalité ne sera pas drastique pendant la période d’incubation de 3 semaines.
9. Incuber les neurones pendant 1 à 2 h dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂.
10. Remplacer le milieu de culture par 100 μL de milieu de culture préchauffé (37 °C) par puits et le remettre dans un incubateur à 37 °C à 5 % de CO₂ (aucun changement de milieu n’est nécessaire pendant la culture).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque à 96 puits	Société Zeon		doué
Plaque à 96 puits	Greiner	655986
B-27	Gibco	Référence 17504-044	2 v/v % pour les plaques MEA ; 50x pour les plaques normales
borax	sigma	Réf. B-9876	Concentration finale 12 mM
acide borique	WAKO	Référence 021-02195	Concentration finale 50 mM
Albumine sérique bovine	Millipore	12659-100G	Concentration finale : 3 % dans le PBS
GlutaMAX	Gibco	Référence 35050-061	2,5 mM pour les plaques MEA ; 400x pour les plaques normales
Dans l’analyseur de cellules 2200	Cytiva		Images de fluorescence
Neurobasale	Gibco	Référence 21103-049
Pénicilline/streptomycine	Gibco	Référence 15140-122	100 U/mL pour les plaques normales
Pénicilline/streptomycine	Nacalai tesque	Référence 26253-84	100 μg/mL pour les plaques MEA
Poly-L-lysine	sigma	Référence P2636	Dilué dans le tampon de borate (concentration finale : 1 mg/mL)
Neurone SKY	AlzMed , Inc.	ARH001	1,0 x 106 cellules/tube