Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Revêtement des lamelles en verre avec de la poly-L-lysine
- Préparez les lamelles en verre en dégivrant une aliquote de 5 mL de solution de poly-L-lysine (PLL) de 200 μg/mL. Diluer cette solution mère à 20 μg/mL en ajoutant 45 mL d’eau pure de qualité injection. Stérilisez la solution par filtre dans un nouveau tube conique de 50 ml. Étiquetez ce tube comme « PLL Sterile ».
note: Utilisez de l’eau stockée à température ambiante pour accélérer le processus de décongélation.
- Ajouter 100 lamelles en verre stériles, rondes et de 12 mm à la solution stérile de LPL. Agitez le tube toutes les 5 à 10 minutes, pendant 2 à 3 minutes, pour assurer un revêtement uniforme. Enduire les lamelles de cette manière pendant 1 h.
note: Les lamelles rondes en verre de fabrication allemande (diamètre = 12 mm) sont préférées, car elles offrent une surface de culture fiable et s’insèrent facilement dans les puits d’une plaque de culture cellulaire à 24 puits.
- Après 40 min d’enrobage PLL, prenez 2 morceaux de papier de soie et posez-les à plat dans l’armoire à flux. Stérilisez le papier avec de l’éthanol à 70 %, puis aplatissez-le pour enlever les plis et laissez-le sécher.
- Après avoir recouvert les lamelles en verre pendant 1 h de PLL, retirez l’excès de solution PLL et ajoutez de l’eau stérile de qualité injection. Agitez doucement les lamelles pendant 2 à 3 s pour permettre l’élimination de l’excès de PLL. Répétez cette étape de rinçage 2 fois de plus.
- Retirez l’excès d’eau, puis transférez les lamelles sur le papier de soie stérile. Séparez soigneusement chaque lamelle à l’aide d’une pince incurvée et laissez sécher.
note: Les lamelles qui ne se séparent pas facilement peuvent être jetées. Alternativement, une petite quantité d’eau peut être ajoutée pour aider à la séparation.
- Une fois sèches, transférez les lamelles dans une plaque de culture à 24 puits.
note: Les lamelles doivent être préparées environ 30 min à 1 h avant de commencer le processus de dissection. Les plaques peuvent être stockées dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
2. Dissociation du tissu hippocampique et cortical
- Préparation de solutions de culture cellulaire
- Pour la dissociation du tissu neural, décongeler d’abord une aliquote de 40 mL de tampon de culture cellulaire (composition [en mM] : 116 NaCl, 5,4 KCl, 26 NaHCO3, 1,3 NaH2PO4, 1 MgSO4·7H2O, 1 CaCl2·2H2O, 0,5 EDTA·2Na·2H2O et 25 D-glucose, pH = 7,4). Mesurer 12 mL de tampon de culture cellulaire dans un tube conique de 15 mL ; comme « BSA ». Doser 5 mL de tampon de culture cellulaire dans un autre tube de 15 mL ; comme « papain ». Incuber les deux tubes dans un bain-marie pendant 15 min à 37 °C.
- Stérilisez par filtre le tampon de culture cellulaire restant, étiquetez-le comme « Tampon - Stérile » et conservez-le à 4 °C jusqu’à ce que vous l’utilisiez.
- Pesez 120 mg d’albumine sérique bovine (BSA) et ajoutez-la dans le tube étiqueté « BSA ». Pesez 7 mg de papaïne et ajoutez-l’ajouter dans le tube étiqueté « papaïne ». Remettez les deux tubes dans le bain-marie pendant 15 min.
note: Il est utile d’ajouter une petite quantité de tampon au bateau de pesée pour faciliter le transfert de la poudre de papaïne.
- Une fois que toutes les poudres sont dissoutes, stérilisez chaque solution par filtre dans un tube conique frais de 15 ml. Pour la papaïne en tube, étiqueter la solution filtrée comme « papaïne - stérile ». Pour les tubes BSA, divisez la solution BSA stérile en 3 tubes, chacun contenant 4 mL de solution BSA. Étiquetez chaque tube comme « BSA - Stérile » et « 1 », « 2 » ou « 3 ». Remettez tous les tubes dans le bain-marie et continuez à incuber à 37 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
- Préparation à la dissection tissulaire
- Prenez un seul morceau de papier filtre de 35 mm (voir tableau des matériaux) et stérilisez avec de l’éthanol à 70 % ; laissez sécher dans le couvercle d’une boîte de Pétri de 100 mm, dans une armoire à écoulement. Disposez les ciseaux, les pinces, le scalpel et la spatule (voir la table des matières) nécessaires à la dissection de l’hippocampe et du cortex.
- Placez deux boîtes de Pétri de 35 mm et une boîte de Pétri de 100 mm contenant du papier filtre stérile dans un endroit accessible au centre de l’armoire d’écoulement.
- Collecter du NexCre transgénique ; Bébés souris Ai9 et VGAT Venus qui doivent être disséqués. Utilisez une lampe fluorescente avec des filtres d’excitation et d’émission appropriés (voir le tableau des matériaux) pour distinguer les petits fluorescents des compagnons de portée de type sauvage.
- Immédiatement avant de disséquer les animaux, remplissez chaque boîte de Pétri de 35 mm avec un tampon de culture cellulaire réfrigéré et stérile.
note: Une boîte de Pétri sert à nettoyer les outils entre les dissections, et l’autre à collecter l’hippocampe et le cortex.
- Dissection tissulaire
- Dès que le tampon de culture cellulaire est versé, décapitez une souris ou un rat transgénique postnatal de 0 à 2 jours à l’aide de gros ciseaux tranchants et utilisez une boîte de Pétri stérile de 100 mm pour transférer la tête dans l’armoire d’écoulement. À l’aide d’une pince, de ciseaux et d’une spatule, transférez soigneusement le cerveau d’un chiot transgénique sur du papier filtre stérile.
- Utilisez un scalpel de type 22 pour disséquer le cervelet et séparer les 2 hémisphères. À l’aide d’une petite spatule, faites rouler les hémisphères latéralement. Sur chaque hémisphère, appuyez doucement pour que le cortex entre en contact avec le papier filtre. Déplacez doucement les régions du mésencéphale pour révéler l’hippocampe et le cortex.
note: Attention à ne pas appliquer trop de pression lorsque vous appuyez sur les hémisphères ou les cellules peuvent être écrasées.
- Utilisez un scalpel ou une spatule pour séparer l’hippocampe et le cortex de chaque hémisphère. Transférez le tissu disséqué dans une boîte de Pétri de 35 mm contenant un tampon de culture cellulaire réfrigéré.
note: Si vous disséquez plusieurs animaux, conservez le tampon de culture cellulaire stérile dans un tube conique de 50 ml sur de la glace. Après chaque dissection, transférez le tissu disséqué dans le tampon de culture cellulaire réfrigéré.
- Après une dissection réussie du tissu cortico-hippocampique, transférez la solution stérile de papaïne du bain-marie dans l’armoire d’écoulement. À l’aide d’une pipette Pasteur de 3 ml, transférez l’hippocampe et le cortex disséqués dans le couvercle d’une boîte de Pétri stérile de 35 mm. Hachez dans un mouvement croisé, à l’aide de la partie plate d’un scalpel de type 22, jusqu’à ce que le tissu soit en petits morceaux.
- Utilisez une petite quantité de solution de papaïne pour transférer le tissu haché du couvercle de la boîte de Pétri vers le tube de papaïne stérile. Remettez le tube de papaïne dans le bain-marie et incubez le tissu à 37 °C pendant 25 min.
- Pendant l’incubation de la papaïne, préparez une solution complète de milieu de fluorescence. Décongeler une aliquote de 1 mL de B27, une aliquote de 0,5 mL de Glutamax et une aliquote de 0,5 mL de Pen-Strep. Aliquote 48,5 mL d’Hibernate Un milieu à faible fluorescence dans un tube conique de 50 mL. Ajoutez B27, Glutamax et Pen-Strep à la solution. Bien agiter la solution, puis filtrer-stériliser et étiqueter comme « Hibernate A full media » (avec la date et les initiales). Incuber à 37 °C au bain-marie.
- Après l’incubation de la papaïne, transférez le tube de papaïne et les tubes BSA stériles dans l’armoire d’écoulement. À l’aide d’une pipette Pasteur de 1 ml, on ne peut prélever que le tissu cortico-hippocampique du tube de papaïne dans le tube BSA 1.
note: Prenez soin de minimiser le transfert de l’excès de solution de papaïne.
- Dissociation des cellules
- Afin de briser les gros amas de tissu, triturez le tissu plusieurs fois à l’aide d’une pipette Pasteur de 1 ml. Ensuite, triturez le tissu 7 fois à l’aide d’une pipette Pasteur à pointe fine. Laissez le tissu reposer pendant 30 secondes, ce qui permet aux plus gros morceaux de tissu de sédimenter.
- Après 30 s, transférez la partie inférieure de 1 mL de solution et de tissu du tube BSA 1 au tube BSA 2. Triturez plusieurs fois le tissu dans le tube BSA 2 à l’aide d’une pipette Pasteur à pointe fine.
- Après la trituration, transférez de nouveau le 1 mL inférieur de tissu et de solution du tube BSA 1, mais maintenant dans le tube BSA 3. Triturez le tissu dans le tube BSA 3 plusieurs fois à l’aide d’une pipette Pasteur à pointe fine.
- Après la trituration, transférez toute la solution et les tissus des tubes 2 et 3 dans le tube BSA 1. Triturer encore 2 à 3 fois et centrifuger à 3 000 x g pendant 3 min.
- Lors de la centrifugation, constituer un milieu basal A neural complet (média NBA). Aliquote 48,5 mL de milieu NBA dans un tube conique de 50 mL et incuber à 37 °C dans un bain-marie. Étiquetez ce tube « NBA uniquement ». De plus, décongelez une aliquote de 1 mL de B27, une aliquote de 0,5 mL de Glutamax et une aliquote de 0,5 mL de Pen-Strep à température ambiante.
- Après la centrifugation, retirer soigneusement le surnageant du tissu granulé et remettre les cellules en suspension dans 2 mL de milieu complet. À l’aide d’une pipette P1000, triturer le tissu de haut en bas 20 fois.
note: Veillez à ne pas pipeter les cellules trop vigoureusement. Si une pression trop importante est appliquée, les cellules peuvent être endommagées.
- À l’aide d’une pipette Pasteur de 1 ml, filtrer la suspension cellulaire à travers un tamis cellulaire de 30 μm dans un tube d’échantillon en polystyrène.
note: Si la suspension cellulaire ne passe pas immédiatement à travers le tamis cellulaire, il peut être nécessaire d’appuyer sur le tamis avec un gant stérile pour démarrer l’écoulement. Cette étape importante permet d’éviter le colmatage du trieur de cellules.
- Pour collecter les neurones après le tri, préparez des tubes de collecte en pipetant 300 μL de milieux complets sur le nombre requis de tubes en polypropylène.
- La suspension cellulaire est maintenant prête à être acheminée vers le trieur de cellules pour le tri. Prenez la suspension cellulaire, les tubes de collecte supplémentaires et les milieux complets de rechange au cas où une dilution de l’échantillon serait nécessaire.
3. Tri cellulaire des neurones GABAergiques ou glutamatergiques purifiés
REMARQUE : Pour minimiser le risque de contamination bactérienne pendant le tri, rincez le tube de l’échantillon du trieur avec de l’éthanol à 70 % pendant au moins 5 minutes avant le tri. Les paramètres de tri détaillés varient d’un instrument à l’autre, les considérations fondamentales sont les suivantes.
- Lors du premier tri cellulaire, établissez les niveaux de fluorescence de fond à partir de cellules non marquées en triant et en comparant les cellules d’un animal de type sauvage.
- Pour chaque type de cellule fluorescente à trier, choisissez les filtres d’excitation et d’émission appropriés. Excitez les protéines Venus et TdTomato en utilisant des longueurs d’onde d’excitation de 488 nm ou 531 nm, respectivement. Détectez la lumière émise grâce aux jeux de filtres d’émission 530/40 et 575/30, respectivement.
- Ajouter des tubes de prélèvement en polypropylène, contenant 300 μL de milieu complet, dans le trieur de cellules pour la collecte de cellules.
- Pour une grande pureté, triez les cellules fluorescentes marquées de manière brillante (voir la figure 1B pour par exemple les diagrammes à points des cellules triées).
- Après le tri, pour des résultats optimaux, effectuez un test de pureté des cellules triées afin d’estimer les niveaux de pureté. Notez que le taux de récupération typique des cellules après le tri se situe entre 70 et 80 %.
- Notez le nombre de cellules triées dans chaque tube de prélèvement. Cette valeur est donnée par l’instrument de tri des cellules.
note: Le tri cellulaire peut être effectué à l’aide d’une buse de 70 μm (pression de fluide de gaine de 70 psi) ou d’une buse de 100 μm (pression de fluide de gaine de 20 psi).
4. Culture de neurones triés
- Après le tri des cellules, transférez les cellules collectées dans des tubes à centrifuger à fond rond de 2 ml, à l’aide d’une pipette Pasteur de 1 ml. Centrifugez les cellules à 3 000 x g pendant 3 min pour former une pastille cellulaire.
note: Pour aider à identifier l’emplacement de la pastille de cellule, orientez les tubes de centrifugation à fond rond avec la charnière du couvercle vers l’extérieur, ce qui permet à la pastille de cellule de se former à l’arrière du tube de centrifugation (c’est-à-dire du même côté du tube que la charnière).
- Pendant la centrifugation, ajoutez 1 mL de B27, 0,5 mL de Glutamax et 0,5 mL de Pen-Strep aux 48,5 mL de média NBA préchauffé. Bien agiter la solution, puis filtrer, stériliser et étiqueter comme « Média complet NBA » (avec date et initiales). Remettre au bain-marie jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
- Après la centrifugation, utiliser une pipette Pasteur de 1 mL pour transférer le surnageant dans un autre tube de centrifugation (conserver le surnageant au cas où la pastille de cellule aurait été perturbée). Remettez en suspension la pastille cellulaire dans la quantité requise de milieu NBA complet préchauffé pour atteindre une densité cellulaire de 1 000 cellules/μL. Remplacez les cellules en suspension en pipetant de haut en bas avec une pipette P200 ou P1000.
- Pour confirmer la présence de cellules dissociées, vérifiez la solution cellulaire au microscope, à l’aide d’une lentille d’objectif 4x ou 10x. Vous pouvez également pipeter une petite quantité de solution cellulaire sur une lamelle et vérifier au microscope. Si un grand nombre de cellules sont présentes, le surnageant de l’étape 4.3 peut être éliminé.
- Avant de plaquer les cellules, agitez à vitesse moyenne pendant 2 à 3 s pour assurer une suspension uniforme des cellules. Après le vortex, pipetez rapidement 10 μL de la suspension cellulaire au centre de chaque lamelle. Après avoir pipeté les cellules, remettez rapidement chaque plaque dans l’incubateur (5 % CO2/37 °C) et incubez pendant 1 h
note: Si vous ajoutez des cellules à plusieurs plaques à 24 puits, assurez-vous que les densités cellulaires sont uniformes en faisant circuler des cellules entre les plaques.
- Après 1 h, nourrissez les cellules avec 500 μL de milieu NBA complet préchauffé et retournez-les dans l’incubateur.
note: Lors de l’alimentation des cellules, il est important de pipeter doucement le milieu sur le côté du puits pour éviter le détachement des cellules. Pour de courtes expériences (<16 jours), il n’est pas nécessaire de nourrir à la densité ci-dessus. Lors de l’ensemencement d’une plus grande densité de cellules, des intervalles d’alimentation plus fréquents peuvent être nécessaires.
