1. Préparation des milieux
REMARQUE : Le protocole repose sur l’utilisation d’un mélange de deux milieux distincts : DMEM/F12 complété par un supplément de N2 modifié et Neurobasal complété par un supplément de B27, généralement dans un rapport de 1:1.
- Préparez le supplément de N2 modifié en mélangeant les composants dans un tube de 15 ml. Ne le vortex pas ou ne le filtre pas ; Mélanger en retournant le tube jusqu’à ce que la solution soit claire.
- Commencez par pipeter 7,2 ml de DMEM/F12, puis ajoutez 1 ml d’insuline à 25 mg/ml (constituée de HCl 0,01 M) et mélangez bien en inversant le tube. Il faut quelques minutes avant que la solution ne soit claire.
- Ajouter 1 ml d’apo-transferrine (100 mg/ml d’apo-transferrine (préparée dans l’eau), 33 μl de progesternone à 0,6 mg/ml (incorporé dans de l’éthanol), 100 μl de putrescine (préparée dans l’eau), 10 μl de 3 mM de sélénite de sodium (préparée dans l’eau) et 666 μl d’albumine sérique bovine à 7,5 % et bien mélanger le tube. Tremper dans 2,5 ml et conserver à -20 °C jusqu’à 2 mois.
- Préparez le support.
- À 250 ml de DMEM/F12, ajoutez 2,5 ml de N2. Mélangez bien mais ne secouez pas et ne filtrez pas.
- À 250 ml de milieu neurobasal, ajoutez 5 ml de supplément de B27. Mélangez bien mais ne secouez pas et ne filtrez pas.
- Mélangez le support des étapes 1.2.1 et 1.2.2 dans un rapport de 1:1. Dans certains cas, un mélange 1:3 peut être nécessaire (complété par un mélange 1:1 à l’étape 1.2.4).
- Ajoutez au mélange 0,5 ml de L-glutamine (concentration finale 0,2 mM) et 3,5 μl de 2-mercaptoéthanol (concentration finale 0,1 mM) et mélangez bien sans agiter. Conservez le support à 4 °C jusqu’à 3 semaines et évitez de l’exposer à la lumière. Ce mixage final s’appelle N2B27.
- Préparez la solution de gélatine.
- Préparez une solution de gélatine à 1 % dans de l’eau ultrapure et un autoclave à 121 °C, 15 psi, pendant 15 min. Il est important que la bouteille utilisée pour cela soit complètement exempte de détergents ou de désinfectants, il est donc recommandé d’utiliser une nouvelle bouteille pour cela et de ne la rincer qu’à l’eau ultra-pure entre les utilisations. Aliquote la solution à 1 % dans 50 ml d’aliquotes et conserver à 4 °C pendant des mois.
- Réchauffer une aliquote de gélatine à 1 % dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à dissolution et l’ajouter à 500 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) chaude. Bien mélanger et pipeter suffisamment pour couvrir le fond de chaque puits ou assiette. Laissez la gélatine recouvrir la surface pendant au moins 30 min.
2. Placage des cellules
REMARQUE : Ce protocole s’applique également aux CSE de souris cultivées dans 10 % de sérum avec facteur inhibiteur de leucémie (LIF), au remplacement sérique par LIF ou à des milieux sans sérum avec LIF et à la protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP4) ou aux inhibiteurs de MEK et GSK3 (milieux 2i) avec ou sans LIF. Cependant, le moment et l’efficacité de la différenciation peuvent varier en fonction des milieux et des cellules. Pour les expériences présentées ici, nous avons utilisé la lignée ESC de souris 46C (avec un rapporteur EGFP enfoncé dans l’un des allèles endogènes de Sox1), cultivée dans GMEM avec 10 % de sérum et LIF. Pour des résultats optimaux, il est important que les cellules soient dissociées et replaquées dans le milieu N2B27 ; le simple fait de changer de milieu de GMEM/sérum/LIF à N2B27 entraîne toujours une efficacité de différenciation réduite par rapport au replacage des cellules.
- Cultivez les cellules dans GMEM avec 10 % de sérum, 1 mM de pyruvate de sodium, 1x acides aminés non essentiels, 0,1 M de 2-mercaptoéthanol et 100 unités/ml LIF13. Pour obtenir une culture sous-confluente d’ESC de souris, plaquez 1 x 106 cellules dans un ballon de culture T25, ce qui prendra 2 à 3 jours.
- Observez les cellules au microscope à fond clair. Lorsque les cellules sont subconfluentes et prêtes à passer, rincez-les deux fois au PBS. Ajouter 1 ml de réactif de dissociation cellulaire et retourner dans l’incubateur pendant 2 à 5 min. Bien que la trypsine et d’autres enzymes puissent également être utilisées pour la dissociation cellulaire, elles peuvent avoir un impact négatif sur l’attachement cellulaire, de sorte que les densités de placage devront être ajustées.
- Une fois que les cellules commencent à se soulever de la plaque, tapotez le récipient pour les déloger en une suspension à cellule unique. Recueillir les cellules dans 10 ml de milieu et de réactif de dissociation cellulaire et pipeter dans un tube à centrifuger de 15 ml.
- Faites tourner les cellules à 300 x g pendant 3 min à RT.
- Aspirez soigneusement le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 10 ml de N2B27 préchauffé en pipetant de haut en bas 3 à 5 fois. Lorsque vous pipetez la suspension vers le bas, pipetez contre le côté du tube pour éviter de créer des bulles. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé ou d’un hémocytomètre et notez la concentration.
- Préparez une suspension cellulaire contenant le nombre désiré de cellules par unité de volume à plaquer par puits dans du N2B27 préchauffé. Une densité de 10 500 cellules parcm2 dans une boîte à 6 puits (c’est-à-dire 1 x 105 cellules par puits d’une boîte à 6 puits) est optimale. Voir le tableau 1 pour le nombre suggéré de cellules parcm2 et les volumes de milieux de placage pour divers récipients de culture cellulaire.
- Aspirer la gélatine du récipient de culture et mettre la suspension cellulaire en plaques selon la densité et le volume suggérés dans le tableau 1. Ne faites pas tourner les plaques, car cela concentrerait les cellules vers le centre. Placez les cultures dans un incubateur humide à 37 °C, 5 % CO2.
- Changez de support tous les 1 à 2 jours en remplaçant tous les supports par du N2B27 frais. Pipetez doucement car le rinçage des cellules pourrait affecter la densité et diminuer l’efficacité de la différenciation dans les jours suivants. Lorsque la viabilité initiale après le placage est faible, plaquez les cellules dans un mélange 1:3 de milieux supplémentés en N2 et B27 et changez-le en N2B27 après les deux premiers jours. Les cellules commenceront à se différencier et devraient montrer l’expression de Sox1 (visible par la fluorescence verte du rapporteur dans la lignée cellulaire 46C utilisée ici) dans les 4 à 6 jours.
Table 1. Densités de placage et volumes de fluides suggérés pour différentes tailles de récipients. Les densités d’ensemencement dans ce tableau ont été déterminées à l’aide de la lignée cellulaire 46C. Pour des résultats optimaux, il peut être nécessaire d’ajuster la densité de placage de chaque ligne.
| plateforme | Plage de densité efficace (cellules/cm2) | Plage du numéro de cellule à la plaque | Volume initial suggéré du support (μl) | Volume de support suggéré après le jour 1 (μl) |
| Plaque à 6 puits | De 10 500 à 36 500 | De 99 750 à 346 750 | 1 000 | 2 000 |
| Plaque à 24 puits | De 15 600 à 46 800 | De 29 640 à 88 920 | 500 | 1 000 |
| Plaque à 96 puits | De 103 500 à 260 000 | De 33 120 à 83 200 | 100 | 200 |
