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1. Différenciation HNSC sur la culture tridimensionnelle (3D)
REMARQUE : Isolez et dérivez des cellules souches neurales humaines (hNSC) à partir d’un tissu éthiquement approuvé décrit dans une publication précédente. Veuillez suivre les directives éthiques et institutionnelles tout en suivant cette procédure.
- Culture 3D à l’aide d’une plaque à 12 puits
- Utilisez une technique aseptique tout au long de la procédure. Dans une enceinte de sécurité biologique, réhydrater les échafaudages en ajoutant 2 ml/puits d’éthanol à 70 % préparé à partir d’eau d’irrigation (WFIr). Évitez de toucher les échafaudages en distribuant l’éthanol à 70 % le long de la paroi de chaque puits.
- Aspirez soigneusement l'éthanol à 70 % et lavez immédiatement les échafaudages avec 2 ml/puits de Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM : F12) pendant 1 min. Répétez la procédure de lavage deux fois. Aspirez soigneusement le DMEM : F12 après le lavage final.
- Enduire les échafaudages en ajoutant 2 ml/puits de laminine (10 μg/ml) dans du DMEM : F12. Incuber la plaque à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 pendant au moins 2 heures. Lavez la plaque avec du DMEM chaud : F12.
- Ensemencez chaque échafaudage avec environ 500 000 hNSC dans un volume de 150 μl de facteurs de croissance RMM+.
- Incuber la plaque pendant 3 h à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 pour permettre aux cellules de s’installer dans les échafaudages.
- Ajoutez 3,5 ml de RMM dans chaque puits en prenant soin de ne pas déloger les cellules des échafaudages.
- Incuber la plaque pendant 7 jours ; remplacer le milieu RMM (3,5 ml/puits) après 1 jour (première alimentation) et à nouveau après 2-3 jours après la première alimentation.