Génération de neurones sympathiques postganglionnaires à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Résumé

Source : Wu, H. F., et al. Différenciation efficace des neurones sympathiques postganglionnaires à l’aide de cellules souches pluripotentes humaines dans des conditions de culture sans nourrisseur et chimiquement définies. J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo présente une méthode in vitro pour générer des neurones sympathiques postganglionnaires à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC). Les hPSC sont différenciées en cellules de crête neurale (NCC) sur un support de matrice de membrane basale à l’aide d’un milieu de différenciation. Les NCC sont ensuite dissociés et formés en sphéroïdes à l’aide d’un autre milieu de différenciation. Enfin, les sphéroïdes sont transformés en neurones sympathiques postganglionnaires à l’aide d’un milieu neuronal sympathique.

Protocole

1. Configuration pour l’enrobage de la parabole, la préparation des milieux et la maintenance des hPSC

1. Revêtement de plat
   1. Revêtement à la vitronectine (VTN)
      1. Placez les flacons de VTN dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce qu’ils soient complètement décongelés, puis mélangez soigneusement.
      2. Pour une boîte de Pétri de 100 mm, mélanger 7 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 0,5 mg/mL de VTN, ajouter la solution de VTN dans la boîte et incuber à température ambiante (RT) pendant 1 h.
   2. Revêtement matriciel de la membrane basale
      1. Décongeler les flacons de matrice de membrane basale (voir le tableau des matériaux) sur de la glace à 4 °C pendant la nuit.
      2. Pour un puits d'une plaque à 6 puits, mélanger 2 mL de milieu et de nutriment Eagle modifié F-12 de Dulbecco (DMEM/F12) avec 20 μL de matrice de membrane basale 100x, ajouter la solution de matrice de membrane basale dans le plat, envelopper le plat d'une pellicule de paraffine et conserver dans un récipient propre à 4 °C pendant la nuit. Travaillez le plus rapidement possible. Les plats enduits peuvent être conservés à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
   3. Revêtement en polyornithine (PO)/laminine (LM)/fibronectine (FN)
      1. Le premier jour, pour un puits d’une plaque de 24 puits, mélanger 15 μg/mL d’OO avec 1 mL de 1x PBS, incuber à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant la nuit. Décongeler LM et FN à -20 °C pendant la nuit et conserver à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient complètement décongelés.
      2. Le deuxième jour, aspirer la solution PO, laver les puits 2 fois avec 1 PBS, ajouter 1 mL de 1 PBS contenant 2 μg/mL de LM et 2 μg/mL de FN et incuber à 37 °C dans 5 % de CO₂ pendant la nuit. À ce stade, la parabole avec la solution LM/FN peut être conservée dans l’incubateur pendant des mois, à condition qu’elle ne se dessèche pas. Ajoutez plus de 1x PBS pour éviter que le plat ne se dessèche.
2. Préparation des milieux
   1. Préparez le milieu Essential 8 (E8) en décongelant une bouteille de supplément E8 à 4 °C pendant la nuit. Mélangez le supplément avec 500 ml de milieu E8 et des antibiotiques si nécessaire.
      note: La solution E8 fonctionnelle doit être utilisée dans les 2 semaines.
   2. Préparez le milieu de congélation hPSC en mélangeant 90 mL de milieu E8 complet avec 10 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO) pour un volume total de 100 mL. Filtrer la stérilisation.
   3. Préparez le milieu de différenciation du jour 0 au jour 1 en mélangeant 100 mL de milieu essentiel 6 (E6) avec 10 μM SB431542, 1 ng/mL de protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP4), 300 nM CHIR99021 et 10 μM Y27632 pour un volume total de 100 mL.
   4. Préparez le milieu de différenciation du jour 2 au jour 10 en mélangeant 100 mL de milieu E6 avec 10 μM SB et 0,75 μM CHIR99021 pour un volume total de 100 mL.
   5. Préparez le milieu sphéroïde du jour 10 au jour 14 en mélangeant un milieu neurobasal avec 2 mL de B27 (50x), 1 mL de N2 (100x), 2 mM de L-glutamate, 3 μM de CHIR99021 et 10 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes-2 (FGF2) pour un volume total de 100 mL.
   6. Préparez le milieu du jour 14 au jour 28 pour l’entretien à long terme du sphéroïde en ajoutant 0,5 μM d’acide rétinoïque (AR) frais au milieu sphéroïde du jour 10 au jour 14 pour chaque repas.
      note: Maintenez toujours l’AR à -80 °C.
   7. Préparez le milieu de maturation SymN en mélangeant un milieu neurobasal avec 2 mL de B27 (50x), 1 mL de N2 (100x), 2 mM de L-glutamate, 25 ng/mL de facteur neurotrophique dérivé de la lignée cellulaire gliale (GDNF), 25 ng/mL de facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF), 25 ng/mL de facteur de croissance nerveuse (NGF), 200 μM d’acide ascorbique et 0,2 mM d’adénosine monophosphate de dibutyryl cyclique (dbcAMP) pour un volume total de 100 mL. La solution doit être utilisée dans les 2 semaines. Avant chaque repas, ajouter 0,125 μM d’AR frais. Cette solution est utilisée à partir du 14e jour (option 1) ou du 28e jour (option 2).
   8. Préparez le tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) en mélangeant du DMEM avec 2 % de FBS, 2 mM de L-glutamate et des antibiotiques si nécessaire pour un volume total de 100 mL.
3. Maintenance des hPSC
   1. Décongélation et conservation des hPSC
      1. Préparez un plat de 100 mm enduit VTN.
      2. Pour décongeler un flacon de hPSC directement à partir d’azote liquide, placez le flacon dans un bain-marie à 37 °C, en balançant soigneusement le tube dans l’eau jusqu’à ce qu’il décongèle. Transvasez les CSPh décongelés dans un tube de 15 mL contenant 10 mL de 1x PBS, et centrifugez-les à 200 x g pendant 4 min.
      3. Jeter le surnageant et ajouter 1 mL de milieu E8 dans le tube. Pipetez quelques fois pour remettre complètement la pastille en suspension, puis ajoutez 9 ml de milieu E8 pour atteindre 10 ml au total.
      4. Aspirer la solution VTN de la parabole de 100 mm.
      5. Transférez les hPSC dans une boîte de 100 mm, secouez doucement (de haut en bas et de gauche à droite, pas en cercles) pour vous assurer que les cellules sont réparties uniformément dans la boîte
      6. Incuber à 37 °C, dans 5 % de CO₂.
      7. Le lendemain, aspirez tout le milieu et donnez 10 ml de E8.
      8. Nourrissez-le de cette façon tous les jours pendant les 3 à 4 prochains jours, puis préparez-vous à vous séparer.
   2. Séparation des hPSC
      REMARQUE : Les hPSC au moment de la division doivent être confluentes à 80 % à 90 %. De grandes colonies aux bords lisses et brillants doivent être observées. Cependant, le contact entre chaque colonie doit être évité (figure 1B, jour 0 et figure 4B).
      1. Préparez des plats de 100 mm revêtus de VTN au besoin.
      2. Aspirez l’E8 et lavez la vaisselle qui doit être divisée 1x avec 1x PBS.
      3. Aspirez le 1x PBS et ajoutez 4 ml de 0,25 M EDTA. Incuber 2 min à 37 °C, 5 % CO₂.
         note: Les hPSC doivent être divisés/replaqués en petites colonies. Ne pas traiter avec de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pendant plus de 2 minutes pour éviter la séparation en cellules uniques. Les cellules doivent être toujours attachées à la surface de la parabole après le traitement de 2 minutes.
      4. Aspirez l’EDTA, détachez les colonies en pipetant fortement 10 mL de milieu E8 sur la surface de la parabole, et collectez tous les milieux et cellules dans un tube de 15 mL.
      5. Avec des hPSC à 80 %-90 % de confluence, divisez les colonies de 1:15-1:20. Par exemple, pour diviser les CSPh par 1:20 dans une boîte de 100 mm, prendre 500 μL de solution E8/CSPh et mélanger avec 9,5 ml de milieu E8 frais.
      6. Plaque hPSC dans des paraboles de 100 mm revêtues de VTN.
         note: Il est conseillé d’établir le rapport de répartition idéal pour chaque chercheur et chaque lignée cellulaire indépendamment.
   3. Congélation des hPSC
      1. Pour une boîte de 100 mm de CSPh prête à être fendue, préparez trois cryoflacons et 3,5 ml de produit de congélation.
         REMARQUE : Les supports et les flacons doivent être conservés à 4 °C ou sur de la glace jusqu’à utilisation.
      2. Aspirez E8 et lavez la vaisselle 2x avec 1x PBS.
      3. Aspirer 1x PBS et ajouter 4 mL de 0,25 M EDTA, incuber pendant 2 min à 37 °C, dans 5 % CO₂,
         REMARQUE : Les CSPh doivent être congelées en petites colonies au moment où elles seraient divisées. Ne traitez pas les cellules avec de l’EDTA plus de 2 minutes pour éviter la séparation en cellules uniques. Les cellules doivent être encore attachées à la surface de la parabole après le traitement de 2 minutes.
      4. Aspirez l'EDTA, détachez les colonies en pipetant fortement 10 mL de 1x PBS sur la surface de la boîte, et collectez tous les milieux et cellules dans un tube de 50 mL.
      5. Ajouter 20 mL de 1x PBS et centrifuger à 200 x g pendant 4 min pour éliminer l’EDTA restant.
      6. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 3 mL de produit de congélation.
      7. Répartissez uniformément les hPSC dans les trois cryoflacons, de 1 mL chacun.
      8. Conserver à -80 °C pendant la nuit dans une boîte de congélation contrôlée ou un sandwich en polystyrène pour assurer une chute lente de la température, puis transférer dans un réservoir d’azote liquide pour un stockage à long terme.

2. Ensemencement des hPSCs pour commencer la différenciation (jour 0)

REMARQUE : les hPSC doivent être prêtes pour la différenciation après avoir été stabilisées (c’est-à-dire être divisées 2 à 3 fois après décongélation). Assurez-vous que les colonies sont saines, avec des bords lisses et brillants et une différenciation minimale (figure 2B).

1. Préparez des plats à membrane basale enrobés de matrice (plats à 24 puits ou à 6 puits) un jour avant le jour 0 au besoin. Apportez les plats à RT au début de la différenciation.
2. Faites en sorte que le milieu de différenciation du jour 0-1 soit nécessaire.
3. Aspirez l’E8 du confluent, prêt à diviser les hPCS, et lavez la vaisselle 2x avec 1x PBS.
4. Ajouter 7 mL d’EDTA 0,25 M par plat de 100 mm, incuber à 37 °C, 5 % CO₂, pendant 15 min
   note: À ce stade, le traitement à l’EDTA est prolongé pour se disperser dans les cellules individuelles.
5. Retirez à la pipette tous les hPSC (ils doivent flotter) et transférez-les dans un tube de 50 ml. Ajoutez la même quantité ou plus de 1x PBS que la solution EDTA pour diluer l’EDTA.
6. Centrifugeuse à 200 x g pendant 4 min.
7. Jeter le surnageant, ajouter 1 mL de milieu de différenciation des jours 0-1 et pipeter pour homogénéiser les cellules. Poursuivez en ajoutant plus de milieu, puis mélangez pour diluer la solution cellulaire à une concentration idéale pour compter les cellules.
   note: Ne pas trop diluer la solution cellulaire. Pour commencer, les cellules d’une boîte pleine de 100 mm doivent être diluées dans 5 mL de milieu.
8. Comptez le numéro de cellulaire à l’aide d’un compteur de cellules automatisé ou d’un hémocytomètre.
9. Diluer la solution cellulaire au besoin pour atteindre 125 000 cellules/^cm2 dans un faible volume final (p. ex., 2 mL par puits pour une parabole à 6 puits ou 500 μL par puits pour une parabole à 24 puits).
   note: Un faible volume aide les cellules à se fixer plus rapidement.
10. Aspirez toute la solution de matrice de membrane basale des boîtes revêtues et plaquez la solution cellulaire dans les puits.
11. Incuber à 37 °C, dans 5 % de CO₂.

3. Induction des cellules de la crête neurale (jour 1 à jour 10, Figure 1A)

1. Le jour 1, nourrissez les cellules avec le milieu de différenciation des jours 0 à 1 (3 ml par puits pour les plats à 6 puits et 1 ml par puits pour les plats à 24 puits).
2. Le jour 2, nourrissez les cellules avec le milieu de différenciation des jours 2 à 10 (3 mL par puits pour les plats à 6 puits et 1 mL par puits pour les plats à 24 puits).
3. À partir de maintenant, les cellules doivent être nourries tous les deux jours jusqu’au jour 10 (c’est-à-dire que le prochain jour d’alimentation sera le jour 4).
   note: À partir du 6e jour, les crêtes NC devraient être détectées (Figure 1B). Pour vérifier si la différenciation a lieu, il est conseillé d’effectuer une culture de différenciation parallèle dans des puits plus petits (c’est-à-dire 24 puits), qui peuvent être colorés pour SOX10/AP2a et utilisés pour l’expression des gènes marqueurs tout au long du temps de différenciation (Figure 1B, C).
4. Si vous triez des cellules, passez à la section 4. Sinon, passez à l’article 5.

4. Tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour le marqueur de crête neurale CD49D et agrégation des cellules NC dans les sphéroïdes

REMARQUE : Pour le tri FACS, les échantillons doivent être conservés sur de la glace et ne pas être exposés à la lumière après la coloration jusqu’au tri.

1. Préparez la mémoire tampon FACS si les cellules sont triées.
2. Préparez le milieu sphéroïde du jour 10 à 14.
3. Le 10e jour, retirez le milieu et lavez-le 1 fois avec 1 PBS.
4. Ajouter la solution de dissociation (voir le tableau des matières) à raison de 2 mL par puits pour une parabole à 6 puits ou 1 mL par puits pour une parabole à 24 puits, et incuber à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 20 min.
5. Retirez tous les hPSC à la pipette et transférez-les dans un tube de 50 ml.
6. Remplissez le reste du tube avec un tampon FACS et centrifugez à 200 x g pendant 4 min.
   note: Chaque tube de 50 mL peut contenir jusqu’à 20 mL ou moins de solution cellulaire. Le volume du tampon FACS doit être suffisamment élevé pour neutraliser la solution de dissociation.
7. Jetez le surnageant, remettez les cellules en suspension avec la quantité appropriée de tampon FACS (~2 mL par puits d’une plaque à 6 puits) et comptez pour déterminer le numéro de cellule.
8. Préparez les échantillons suivants.
   1. Echantillon 1 (témoin non coloré) : 1 x 10⁶ cellules dans 400 μL de tampon FACS. Filtrez les cellules à travers un capuchon de crépine de 20 μm et maintenez le tube sur de la glace.
   2. Échantillon 2 (contrôle DAPI uniquement) : 1 x 10⁶ cellules dans 400 μL de tampon FACS contenant 0,5 μg/mL de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Filtrez les cellules à travers un tube FACS avec un capuchon de crépine et maintenez le tube sur de la glace.
   3. Échantillon 3 (marqué au CD49D) : Mettre en suspension le reste des cellules avec un tampon FACS contenant l’anticorps CD49D conjugué à la phycoérythrine/cyanine7 (PE/Cy7) (5 μL pour 1 x 106 cellules par 100 μL de tampon FACS) dans un tube de 15 mL et incuber sur de la glace pendant 20 min.
9. Remplissez les tubes avec un tampon FACS et centrifugez à 200 x g pendant 4 min.
10. Jetez le surnageant et mettez-le en suspension toutes les 5 à 10 x 10⁶ cellules dans 1 mL de tampon FACS contenant 0,5 ug/mL de DAPI selon les instructions du fabricant.
11. Filtrez les cellules à travers le tube FACS avec le capuchon de la crépine et maintenez le tube sur de la glace.
12. Préparez des tubes FACS de collecte contenant 2 mL de tampon FACS.
13. Faites le tri dans la machine FACS avec des lasers capables de détecter DAPI et PE-Cy7 pour isoler la population CD49D⁺.
14. Après le tri, comptez les cellules triées.
15. Centrifuger toutes les cellules triées et remettre en suspension le milieu sphéroïde du jour 10 à 14 jusqu’à une concentration finale de 0,5 x 10⁶ cellules par 500 μL de milieu.
16. Plaque 0,5 x 10⁶ cellules par puits dans des plaques à fixation ultra-basse de 24 puits.
17. Incuber les cellules à 37 °C, dans 5 % de CO₂.

5. Agrégation des cellules NC dans les sphéroïdes

1. Si vous n’utilisez pas FACS pour isoler les cellules NC et que vous les agrégez directement en sphéroïdes, préparez d’abord les cellules comme décrit aux étapes 4.2 à 4.5.
2. Remplissez le reste du tube avec 1x PBS et centrifugez à 200 x g pendant 4 min.
3. Jeter le surnageant, remettre les cellules en suspension avec une quantité appropriée de milieu sphéroïde des jours 10 à 14 (p. ex., ~2 mL de milieu par puits pour une plaque à 6 puits) et compter pour déterminer le nombre de cellules.
4. Diluer les cellules dans le milieu sphéroïde des jours 10 à 14 à 0,5 x 10⁶ cellules par 500 μL de milieu.
5. Plaque de 500 μL de suspension cellulaire par puits dans des plaques à 24 puits à fixation ultra-basse.
6. Incuber les cellules à 37 °C, dans 5 % de CO₂.

6. Maintenance du sphéroïde NC et induction du progéniteur sympathique (jour 10 à jour 14, Figure 3A)

1. Option 1 : Culture minimale de sphéroïdes
   1. Le 11e jour, ajouter 500 μL de milieu sphéroïde des jours 10 à 14 aux sphéroïdes NC sans aspirer le milieu existant à partir du jour 10. Incuber à 37 °C, dans 5 % de CO₂.
   2. Le jour 12, inclinez la plaque pour accumuler les sphéroïdes NC d’un côté des puits. Aspirez et jetez soigneusement la quantité de milieu que possible, et donnez avec 1 ml de milieu sphéroïde du jour 10 à 14.
   3. Continuez à nourrir les cellules tous les jours jusqu’au 14e jour.
   4. Facultatif : Si les sphéroïdes s’agrègent et génèrent un gros amas, utilisez une pipette pour briser les amas de sphéroïdes. Cela permet également de s’assurer que les sphéroïdes individuels ne deviennent pas trop grands.
      note: La plage de taille idéale des sphéroïdes doit se situer entre 100 et 500 μm. Dans cette fourchette, la taille des sphéroïdes individuels n’est pas critique. Cependant, la morphologie, comme des bords lisses et clairs (Figure 2 et Figure 4) est importante pour la poursuite du succès. Au 14e jour, chaque plaque à 24 puits contient idéalement environ 50 à 60 sphéroïdes de différentes tailles dans la gamme de tailles mentionnée ci-dessus.
2. Option 2 : Culture de sphéroïdes élargie
   1. Le 15e jour, pour conserver les sphéroïdes NC, servir avec 1,5 mL de milieu sphéroïde des jours 10 à 14 contenant 0,5 μM d’AR. Incuber à 37 °C, 5 % CO₂.
      note: L’AR doit être ajouté frais à chaque repas et toujours conservé à -80 °C.
   2. À partir de maintenant, nourrissez tous les deux jours jusqu’au 28e jour, puis poursuivez le placage des sphéroïdes (section 7.1).
      note: Les sphéroïdes en croissance sont divisés environ 1 fois par semaine en les pipetant avec une pipette de 1 mL pour les briser. Ils sont divisés selon un rapport approximatif de 1:2–1:4. Au cours de la période d’expansion de 2 semaines, le nombre de cellules devrait à peu près quadrupler.

7. Différenciation et maturation des neurones sympathiques (SymN) (Option 1 : après le 14e jour ; Option 2 : après le 28e jour)

1. Dressage de sphéroïdes dans des plats réguliers
   1. Préparez des plaques à 24 puits revêtues de PO/LM/FM.
   2. Préparez un milieu symN contenant 0,125 μM d’AR (ajouter frais à chaque repas) et 10 μM d’Y27632 (jour 14 seulement).
   3. Le jour 14, inclinez la plaque pour accumuler les sphéroïdes NC d’un côté des puits. Aspirez et jetez soigneusement autant de milieu que possible, et donnez 1 mL de milieu symN.
   4. Retirez LM/FN des plaques revêtues.
   5. Divisez et plaquez chaque puits de la plaque à 24 puits en 4 puits séparés de la nouvelle plaque à 24 puits enduite. Chaque puits d’origine contiendra 1 ml, contenant ~50 à 60 sphéroïdes. Cela donne 250 μL, contenant environ 10 à 15 sphéroïdes pour chaque puits sur la nouvelle plaque.
   6. Ajouter 250 μL de milieu supplémentaire par puits.
      note: Il s’agit d’une répartition de 1:4 ; Assurez-vous que les sphéroïdes sont correctement répartis dans la solution afin que la répartition soit relativement uniforme. Le nombre de sphéroïdes n’est pas compté car le nombre final n’affecte pas le succès de la génération des symNs.
   7. Incuber à 37 °C, 5 % CO₂.
   8. Le jour 15 (ou le jour 29 pour l’option 2), servir en remplaçant tout le milieu par 1 mL de milieu symN contenant 0,125 μM d’AR. Désormais, les neurones doivent être nourris tous les 2 jours jusqu’au jour 20 (ou au jour 35 pour l’option 2).
   9. Après le jour 20 (ou le jour 35 pour l’option 2), les neurones doivent être nourris en remplaçant soigneusement seulement la moitié du milieu existant (500 μL). Désormais, nourrissez toutes les semaines à moins que le milieu ne jaunisse rapidement.
   10. Continuez à nourrir chaque semaine jusqu’au moment souhaité.
       REMARQUE : les symNs ont tendance à s’agréger en structures ressemblant à des ganglions et ont tendance à se détacher des boîtes de culture. Pour éviter cela, il est recommandé de manger à moitié et de manipuler minimalement.

Résultats

Figure 1 : Induction CN. (A) Chronologie et traitements de l’induction de la NC du jour 0 au jour 10. (B) La morphologie et la formation des crêtes NC ont été surveillées tous les 2 jours par microscopie à fond clair. Les cellules à chaque point temporel après le jour 2 ont été co-marquées pour AP2A (rouge) et SOX10 (vert). Toutes les images d’immunofluorescen...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîtes de culture cellulaire de 100 mm	Faucon	353003
Tubes coniques de culture de tissus de 15 mL	VWR/Corning	Référence 89039-664
Plaques de culture tissulaire à 24 puits	Faucon	353047
Plaques de fixation ultra-basses à 24 puits	Corning	07 200 601 et 07 200 602
Incubateur de culture tissulaire 5 % CO2/20 % O2	Thermo Fisher/Life Technologies	Heracell VIOS 160i
Tubes coniques de culture tissulaire de 50 ml	VWR/Corning	Référence 89039-656
Plaques de culture tissulaire à 6 puits	Costar	Référence 3516
Accutase	Innovation Technologies des cellules	AT104500	Solution de dissociation cellulaire
Anticorps anti-AP2a	Abcam	AB108311	Hôte : Lapin ; dilution 1:400
Anticorps anti-Ascl1	BD Pharmingen	556604	Hôte : IgG1 de souris ; dilution de 1:200
Anticorps anti-CD49D	BioLégende	304313	Hôte : IgG1 de souris ; 5 μl/million de cellules dans un volume de 100 μl
Anticorps anti-CD49D (isotype)	BioLégende	400125	Hôte : IgG1 de souris ; 5 μl/million de cellules dans un volume de 100 μl
Anticorps anti-DAPI	sigma	D9542	Dilution 1:1000
Anticorps anti-DBH	Immunostar	Référence 22806	Hôte : Lapin ; dilution 1:500
Anticorps anti-GFP	Abcam	AB13970	Hôte : Poulet ; dilution 1:1000
Anticorps anti-HOXC9	Biotechnologie de Santa Cruz	SC-365692	Hôte : IgG1 de souris ; dilution de 1:100
Anticorps anti-NET1	Mab	NET17-1	Hôte : Souris ; dilution 1:1000
Anticorps anti-PRPH	Biotechnologie de Santa Cruz	SC-377093/H0112	Hôte : IgG2a de souris ; dilution de 1:200
Anticorps anti-SOX10	Abcam	AB50839	Hôte : Souris ; dilution de 1:100
Anticorps anti-TH	Pel-Freez	P40101- 150	Hôte : Lapin ; dilution 1:500
acide ascorbique	sigma	A8960-5G	Concentration de la matière : 100 mM
Supplément B27	Thermo Fisher/Life Technologies	Référence 12587-010	Concentration du stock : 50x
Le BDNF	Systèmes de R&D	248-BD	Concentration de la matière : 10 μg/mL
BMP4	Systèmes de R&D	314-BP	Concentration de la matière : 6 mM
Compteur de cellules	Thermo Fisher/Life Technologies	Comtesse II
Lames de chambre de comptage cellulaire	Invitrogen	Réf. C10312
centrifugeuse	Eppendorf	57021 et 5424R
CHIR99021	Systèmes de R&D	4423	Concentration de la matière : 6 mM
Cryo-flacon	Thermo Fisher/Life Technologies	375353
dbcAMP	sigma	D0627	Concentration de la matière : 100 mM
DMEM	Thermo Fisher/Life Technologies	Référence 10829-018	Concentration du stock : 1x
DMEM/F12	Thermo Fisher/Life Technologies	Référence 11330-057	Concentration du stock : 1x
Dmso	Thermo Fisher/Life Technologies	Réf. BP231-100
E6 moyen	gibco	Référence A15165-01
E8 moyen	gibco	Référence A15169-01	Concentration du stock : 1x
Supplément E8	gibco	Référence A15171-01	Concentration du stock : 50x
Edta	sigma	ED2SS	Concentration de la crosse : 0,5 M
Machine FACS	Beckman Coulter	CytoFLEX (pour FACS)
Machine FACS	Beckman Coulter	MoFlo Astrios EQ (pour le tri)
Tubes FACS (capuchon filtrant bleu)	Faucon	352235
Tubes FACS (capuchon blanc)	Faucon	352063
Sérum fœtal bovin (FBS)	Produits biologiques d’Atlanta	Réf. S11150
GDNF	PeproTech	450	Concentration de la matière : 10 μg/mL
Geltrex	Invitrogen	A1413202	Matrice de membrane basale ; Concentration du stock : 100x
hPSC	Thomson et coll., (1998)	WA09
hPSC	Oh et al. (2016)	H9-PHOX2B ::eGFP
Fibronectine humaine (FN)	VWR/Corning	Référence 47743-654	Concentration de la pâte : 1 mg/mL
L-glutamine	Thermo Fisher/Gibco	Référence 25030-081	Concentration de la matière : 200 mM
Réservoir LN	Systèmes biogéniques sur mesure	V-1500AB
Laminine de souris I (LM)	Systèmes de R&D	Référence 3400-010-01	Concentration de la pâte : 1 mg/mL
Supplément N2	Thermo Fisher/Life Technologies	Référence 17502-048	Concentration du stock : 100x
Milieu neurobasal	gibco	Référence 21103-049	Concentration du stock : 1x
Le GNF	PeproTech	Référence 450-01	Concentration de la pâte : 25 μg/mL
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Gibco	Référence 14190-136	Concentration du stock : 1x
Bromhydrate de poly-L-ornithine (PO)	sigma	Réf. P3655	Concentration de la pâte : 15 mg/mL
Primocin (antibiotiques)	InvivoGen	ANTPM1	Concentration du stock : 50 mg/mL
Machine qPCR	Laboratoires Bio-Rad	C1000 Tactile
Plaques qPCR	Laboratoires Bio-Rad	HSP9601
FGF2 recombinant	Systèmes de R&D	233-FB/CF	Concentration de la matière : 10 μg/mL
Acide rétinoïque	sigma	R2625	Concentration de la matière : 1 mM
SB431542	Tocris/Systèmes de R&D	1614	Concentration de la matière : 10 mM
Trypan bleu	Corning	MT-25-900-CI
Vitronectine (VTN)	Thermo Fisher/Life Technologies	A14700	Concentration du stock : 0,5 mg/mL
Bain-marie	VWR/Corning	706308
Y27632	Systèmes de R&D	1254	Concentration de la matière : 10 mM