$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Préparatifs
- Préparez 10 ml de milieu de dissection et ajoutez 200 μl de pénicilline-streptomycine 100x dans 9,8 ml de milieu Eagle modifié F12 de Dulbecco (DMEM/F12).
- Préparez une solution de L-cystéine dans 10 ml d’eau pour la culture tissulaire et ajoutez 120 mg de L-cystéine. Conservez la solution de L-cystéine à 4 °C jusqu’à 2 semaines ou dans des aliquotes à -20 °C jusqu’à 1 an.
- Préparez la solution de DNase I : dans 1 ml d’eau pour la culture tissulaire, ajoutez 10 mg de DNase I. Conservez la solution de DNase I à 4 °C jusqu’à 2 mois.
- Préparez la solution de papaïne : pour préparer la solution de papaïne, ajoutez 100 μl de papaïne (environ 140 unités), 100 μl de DNase I (1 %) et 200 μl de L-cystéine (12 mg/ml) dans 5 ml de DMEM/F12. Préparez fraîchement la solution de papaïne à chaque fois et stérilisez-la avec un filtre à pores de 0,22 μm avant utilisation.
- Préparez la solution de lavage : pour préparer 100 ml de solution de lavage, ajoutez 650 μl de glucose 45 %, 500 μL d'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique, HEPES 1 M et 5 ml de sérum bovin fœtal (FBS) dans 93,85 ml de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) 1x. Stérilisez la solution de lavage avec un filtre de taille de pores de 0,22 μm avant utilisation. Conservez la solution de lavage à 4 °C jusqu’à 2 mois.
- Préparez la solution d’insuline : pour préparer 2 ml de solution d’insuline, ajoutez une goutte de 25 μl d’hydroxyde de sodium 10 N (NaOH) et 100 mg d’insuline dans 2 ml d’eau pour la culture tissulaire.
- Préparez des solutions de facteur de croissance épidermique (EGF) et de facteur de croissance des fibroblastes (FGF) : Dissoudre les deux mitogènes dans le DMEM/F12 à une concentration de 100 μg/ml. Conserver sous forme d’aliquotes de 10 μl à -20 °C.
- Préparez les milieux B-27 et N-2 : conservez les suppléments de B-27 et N-2 à -20 °C sous forme d’aliquotes de 500 μl et 1 ml, respectivement.
- Préparez un milieu de condition de différenciation Z : pour préparer 100 ml de milieu de condition de différenciation Z, ajoutez 40 μl d’insuline (50 mg/ml), 500 μl de B-27, 1 ml de N-2, 650 μl de glucose à 45 % et 1 ml de 100 x pénicilline-streptomycine dans 97,81 ml de DMEM/F12. Stérilisez le milieu de condition de différenciation Z avec un filtre de taille de pores de 0,22 μm avant utilisation. Conservez le milieu de condition de différenciation Z à 4 °C pendant 1 semaine maximum.
- Préparez un milieu de condition Z : pour préparer 50 ml de milieu de condition Z, ajoutez 10 μl d’EGF et 10 μl de FGF dans 50 ml de milieu stérile de condition de différenciation Z (20 ng/ml). Conservez le milieu de condition Z à 4 °C pendant 1 semaine maximum.
- Préparez la solution d’enrobage pour la culture de différenciation : pour 5 ml de solution d’enrobage extracellulaire, ajoutez 100 μl de la solution de matrice extracellulaire (par exemple, Matrigel) dans 4,9 ml de DMEM/F12. Décongeler une solution matricielle extracellulaire à 4 °C sur de la glace. Une fois décongelé, conserver à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
2. Dissection du cerveau du poisson-zèbre adulte
- Préparez un lit de dissection en remplissant une boîte de Pétri de 100 mm x 15 mm avec des blocs réfrigérants. Placez ensuite le couvercle sur la boîte de Pétri et incubez à -20 °C jusqu’à ce que le gel gèle. Sur le dessus du couvercle, placez un carré de papier filtre propre et enveloppez le papier filtre et la boîte de Pétri d’un film plastique.
- Nettoyez et stérilisez tous les instruments de microdissection à l’éthanol à 70 % ou à la chaleur avant chaque utilisation. Placez tous les instruments de dissection stérilisés près du microscope de dissection et, juste avant l’euthanasie, placez le lit de dissection sous le microscope avec un éclairage par fibre optique.
- Collectez 2 poissons-zèbres adultes pour une préparation complète de la neurosphère du cerveau ; et 3 à 4 poissons-zèbres pour générer des neurosphères à partir de régions cérébrales disséquées.
- Euthanasier le poisson-zèbre adulte (âgé de 8 à 12 mois) en suivant un protocole approuvé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux. Ensuite, plongez le poisson dans de l’éthanol à 75 % pendant 5 à 10 secondes et placez-le rapidement dans le lit de dissection suivi d’une décapitation au niveau des branchies à l’aide d’une lame chirurgicale.
- Pour euthanasier les animaux, administrez une surdose (300 mg/L) de sulfonate de tricaïne méthane jusqu'à ce que le rythme cardiaque de l'animal ralentisse progressivement et que la circulation cesse, puis immergez-le dans de l'eau glacée.
- Tournez la tête côté dorsal vers le bas et, à l’aide des ciseaux, faites une coupe longitudinale du côté coupé à la bouche. À l’aide de la pince, exposez la base du crâne et retirez tous les tissus adjacents. Coupez les parois latérales du crâne du début de la moelle épinière vers le tectum.
- À l’aide des ciseaux, coupez et retirez les nerfs optiques, puis retirez les deux côtés de la partie la plus latérale du crâne au niveau du tectum. Tournez la tête ventrale vers le haut. À l’aide d’une pince, décollez le reste de la partie la plus apicale du crâne.
- Transférez le cerveau avec la partie restante du crâne dans une nouvelle boîte avec le milieu de dissection (1.1). Nettoyez le tissu cérébral dans le milieu de dissection à l'aide du manche en plastique du micro-couteau, en gardant toutes les structures cérébrales intactes.
- À partir de ce point, continuez le protocole en utilisant tout le cerveau du poisson-zèbre.
- Vous pouvez également adapter ce protocole à des régions cérébrales spécifiques pour générer des neurosphères à partir de l’ensemble du cerveau du poisson-zèbre ou du télencéphale, du tectum/diencéphale ou du cervelet disséqué avec un scalpel frais. Utilisez une lignée transgénique neuronale fluorescente de poisson-zèbre pour disséquer la région cérébrale d’intérêt selon la figure 1.
3. Dissociation d’une cellule unique du cerveau adulte
- Effectuer tous les travaux subséquents dans une enceinte de sécurité biologique. Transférez le tissu cérébral dans un tube de 1,5 ml contenant 800 μl de milieu de dissection (préparé à l’étape 1.1). Retirez le milieu de dissection par pipetage, sans toucher le tissu cérébral.
- Ajouter 500 μl de solution de papaïne (étape 1.4) et digérer le tissu cérébral à 37 °C pendant 10 min. Ne pas incuber plus de 15 minutes car cela pourrait diminuer la viabilité cellulaire.
- Après l’incubation, transférez le tissu cérébral avec 500 μl de la solution de papaïne dans un tube conique de 15 ml à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 μl coupée à ~0,25 pouce du fond. Dissociez doucement le tissu cérébral en pipetant lentement de haut en bas 10 fois avec la même pointe. Ne faites pas de pipette de haut en bas plus de 15 fois et ne générez pas de bulles d’air pendant cette étape, car cela pourrait altérer la viabilité cellulaire.
- Incuber à nouveau le tissu cérébral à 37 °C pendant 10 minutes, puis pipeter de haut en bas 10 à 13 fois à l’aide d’une pointe régulière non coupée de 1 000 μl. Ne faites pas de pipette de haut en bas plus de 15 fois, pour éviter la mort cellulaire.
- Arrêtez la digestion enzymatique en ajoutant 2 ml de solution de lavage (étape 1.5) et centrifugez la suspension cellulaire à 800 x g pendant 5 min à température ambiante (RT). Décantez soigneusement le surnageant et remettez la pastille en suspension dans la solution restante en tapotant vigoureusement le tube avec un doigt, puis en pipetant de haut en bas avec une pointe régulière de 1 000 μl. Ensuite, ajoutez 2 ml de solution de lavage.
- À ce stade, vérifiez au microscope qu’une suspension unicellulaire a été obtenue. Centrifugez à nouveau la suspension cellulaire à 800 x g pendant 5 min à RT. Retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension à l’aide de 1 ml de milieu frais à condition Z (étape 1.10).
- Colorez les cellules à l’aide du bleu trypan et comptez les cellules vivantes à l’aide d’un hémocytomètre en excluant les cellules mortes bleues. Préparez une plaque à 24 puits avec 200 μl de suspension cellulaire et 300 μl de milieu frais à condition Z dans chaque puits. Cellules germes à une densité de ~500 cellules/μl. Maintenir les cellules cultivées dans un incubateur à 30 °C à 5 % de CO2, car les neurosphères dérivées du cerveau du poisson-zèbre ne se développent pas bien à 37 °C.
4. Génération des neurosphères primaires
- Après 1 jour in vitro (DiV1), observez au microscope la suspension de cellule unique obtenue à partir du cerveau entier adulte et notez si des débris se sont accumulés au centre du puits. Enlevez soigneusement tous les débris en pipetant environ 100 μl de fluide (moins si possible). Ajoutez ensuite 100 μl de milieu frais à condition Z. Les suspensions de cellules uniques doivent être observées à ce moment (Figure 2A DiV1).
- Après 2 jours in vitro (DiV2), dilatez les cellules cultivées. À l’aide d’une pipette de 1 000 μl avec la pointe coupée, prélevez et transférez 250 μl de suspension cellulaire de chaque puits dans un nouveau puits. Ajouter 250 μl de milieu frais à condition Z dans tous les puits. Avant d’élargir les cellules cultivées, homogénéisez la suspension très doucement en pipetant de haut en bas dans tout le puits.
- Répétez les étapes 4.1 et 4.2 pendant les 4 jours suivants in vitro (DiV4). Une augmentation progressive de la taille des neurosphères devrait être visible au centre et aux bords du puits au niveau de DiV3 et DiV4 (Figure 2B et C).
note: Les neurosphères primaires peuvent être traitées pour le passage ou la différenciation afin d’évaluer la multipuissance. Alternativement, ils peuvent être traités pour la nucléofection ou la lipo-transfection afin de caractériser le rôle de gènes spécifiques pendant le processus de différenciation.
5. Passage des neurosphères primaires
- Prélever 250 μl de culture tissulaire de chaque puits et dissocier mécaniquement les neurosphères DiV4 à l’aide d’une pipette de 1 ml. Ne faites pas de pipette de haut en bas trop rapidement, car la formation de bulles d’air peut augmenter la mort cellulaire.
- Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et répartissez 800 cellules/μl dans 250 μl de surnageant de culture primaire dans chaque puits d’une plaque à 24 puits.
- Ajouter 250 μl de milieu de condition Z dans chaque puits.
- Après 2 jours in vitro (DiV2), élargissez les cellules cultivées comme indiqué aux étapes 4.2 et 4.3.
6. Différenciation des neurosphères primaires
- Stérilisez les verres de protection par immersion dans de l’éthanol à 70 % pendant 10 min, puis faites sécher les verres de couverture à RT en les plaçant dans chaque puits d’une plaque à 12 puits.
- Ajouter 300 μl de solution de revêtement extracellulaire (étape 1.11) au centre du verre de protection de manière à ce qu’il puisse se dilater largement et couvrir l’ensemble du verre de couverture. Ensuite, incuber à 37 °C pendant 1 h (à l’aide de l’incubateur de culture cellulaire humidifié).
- Retirer la solution d’enrobage extracellulaire après l’incubation et sécher le verre de protection pendant 2 heures à 37 °C.
- Prélever 250 μl de culture tissulaire de chaque puits. Dissociez mécaniquement toutes les neurosphères primaires de DiV4 par puits avec une pipette de 1 ml (avec une pointe plus large) en pipetant de haut en bas.
- Amorcer des suspensions de cellules de la neurosphère dissociée à une densité cellulaire de 4 x 103 cellules/ml sur des verres de couverture préalablement préparés (étapes 6.1-6.3) et conserver pendant au moins 30 min, à 30 °C dans 5 % de CO2, jusqu’à ce qu’ils soient fixés au substrat. Ensuite, retirer le milieu de culture et ajouter rapidement 1 ml de milieu frais préchauffé (étape 1.9) avant de cultiver les cellules pendant 24 heures à 30 °C dans 5 % de CO2.
- Tous les deux jours, remplacez la moitié du milieu de la condition de différenciation Z pendant la période de différenciation cellulaire.
