Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Génération d’organoïdes cérébraux (23 jours)
- Initiation du neuroectoderme (5 jours)
REMARQUE : Les points suivants doivent être pris en compte avant de commencer la différenciation. La méthode de reprogrammation (à base de lentiviraux, de virus Sendai, épisomiques ou de microARN, etc.) pour obtenir des cellules souches embryonnaires humaines devrait idéalement être la même pour toutes les lignées de cellules souches épiscopales chez les patients et les témoins. Divers kits de reprogrammation et instructions basés sur des protocoles publiés sont disponibles. La qualité des lignées humaines iPSC est la clé pour réaliser une différenciation optimale. Surveillez la morphologie des colonies et des cellules au microscope et validez la pluripotence en testant l’expression de marqueurs tels que Oct3/4, Nanog ou TRA-1-60.
- Cultiver des iPSC humaines dans des conditions sans mangeoire dans le milieu A sur une parabole recouverte d’une matrice Engelbreth-Holm-Swarm (EHS).
note: Cultivez des iPSC humaines sans mangeoire et sans sérum pour maintenir une condition de culture définie et éviter une étape supplémentaire pour l’élimination des cellules nourricières embryonnaires de souris (MEF) avant le début de la différenciation. Le nombre de passages optimal pour que les iPSC humaines commencent la différenciation varie du passage 15 lors de la reprogrammation au passage 70 au total. Lors du passage, détacher les colonies de hiPSC au fur et à mesure que les cellules s’agrègent à l’aide d’une solution de détachement cellulaire appropriée à faible contrainte mécanique et d’une pipette sérologique de 2 mL pour transférer les agrégats dans une nouvelle boîte. Évitez la dissociation en cellules uniques, car cela pourrait induire la différenciation et l’apoptose dans la plupart des lignées d’iPSC. Il a été rapporté que le passage à long terme d’une cellule unique pourrait augmenter les altérations génomiques dans les iPSC humaines. Évitez les procédures de détachement de cellule, qui nécessitent une étape de centrifugation pour éliminer la solution de détachement, car cela réduit la viabilité globale des iPSC. Tester régulièrement toutes les cultures pour détecter les contaminations microbiennes, en particulier les mycoplasmes, car cela pourrait altérer la qualité des iPSC et leur capacité de différenciation.
- Enduire une boîte de culture tissulaire de 60 mm avec une matrice EHS selon les instructions du fabricant.
- Décongeler une aliquote de 1 x 106 iPSC humaines. Ensemencer les iPSC dans une boîte de culture tissulaire de 60 mm recouverte d’une matrice EHS et contenant 5 mL de milieu A (voir le tableau des matériaux). Changer le milieu quotidiennement et passer après 5 à 7 jours lorsque les cellules atteignent ~80 % de confluence.
note: Passez les iPSC décongelées à 80 % de confluence en utilisant des méthodes standard, telles que le détachement sans enzyme des colonies, au moins une fois avant de commencer la différenciation. En bref, retirez le milieu iPSC, lavez les cellules une fois avec du milieu modifié Dulbecco's Eagle's : Mélange nutritif F-12 (DMEM/F12) préchauffé à 37 °C, et incubez les iPSC en suivant les instructions du fabricant à l'aide du réactif A (voir le tableau des matériaux). Ne dépassez pas le temps d'incubation recommandé afin d'éviter la dissociation en cellules uniques. Les iPSC humaines doivent être détachées et flottantes en tant qu’agrégats, et non en tant que cellules uniques. Ils peuvent ensuite être transférés dans de nouvelles antennes à revêtement matriciel EHS ; par exemple, les agrégats iPSC d’une parabole de 60 mm peuvent être distribués à 4 nouvelles paraboles de 60 mm.
b. Vérifiez la présence de mycoplasmes à l'aide d'un kit de détection de mycoplasmes conformément aux instructions du fabricant. N’utilisez que des CSPi exemptes de mycoplasmes, car les mycoplasmes peuvent modifier la capacité de différenciation des CSPi.
- Dissocier les iPSC (80 % confluents) et préparer une suspension unicellulaire à l’aide du réactif B
- Lavez les iPSC une fois avec du DMEM/F12 préchauffé (37 °C).
- Ajouter le réactif B préchauffé (p. ex., 1 mL dans une boîte de 60 mm) et incuber les CSPi pendant 5 minutes à 37 °C et 5 % de CO2.
- Effleurez 20 fois du bout du doigt sur le côté et le dessous de l’antenne pour détacher les iPSC. Vérifiez le détachement des cellules au microscope.
- Pipetez la suspension cellulaire de haut en bas dans la boîte 5 fois à l’aide d’une micropipette de 1 ml.
- Ajouter 3 mL de milieu A pour diluer 1 mL de réactif B et recueillir la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 mL.
- Essorez doucement les iPSC (500 x g) pendant 4 min à température ambiante.
- Remettre la pastille cellulaire en suspension dans 1 mL de milieu B et compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
note: Veillez à n’utiliser que le milieu B pour la remise en suspension. Évitez d’utiliser le milieu A, car il contient une concentration trop élevée de bFGF, ce qui pourrait inhiber la différenciation.
- Diluer la suspension cellulaire à 4,5 x 105 cellules par mL dans le milieu B complété par un inhibiteur de la protéine kinase rho-associé à 10 μM (Y-27632).
- Ajouter 100 μL par puits dans une plaque non adhérente, à fond en V, à 96 puits.
note: Assurez-vous que les cellules sont uniformément réparties dans la suspension en secouant le tube à chaque fois avant de prélever des portions de 100 μL. Il est important que chaque puits contienne un nombre de cellules équivalent afin d’obtenir des neurosphères homogènes en taille et en forme (surfaces rondes et définies).
- Tournez doucement la plaque avec les cellules à 500 x g et à température ambiante pendant 3 min et incubez à 37 °C et 5 % de CO2.
- Changez le milieu tous les jours en retirant 50 μL et en ajoutant 50 μL de milieu B frais dans chaque puits pendant les 5 jours suivants.
2. Intégration des neurosphères dans la matrice EHS (4 jours)
- Préparez le milieu neurosphérique en mélangeant les éléments suivants : mélange 1:1 de DMEM/F12 et de milieu C (v/v), supplément 1 1:200 (v/v), supplément 2 1:100 (v/v) sans vitamine A, L-glutamine 1:100, 0,05 mM d’acides aminés non essentiels (MEM), pénicilline 100 U/mL, 100 μg/mL de streptomycine, 1,6 g/L d’insuline et 0,05 mM de β-mercaptoéthanol.
- Prélever les neurosphères à l’aide d’une micropipette de 200 μL à l’aide d’une pointe de ~2 mm préalablement découpée avec des ciseaux stériles.
- Placez les neurosphères à environ 5 mm les unes des autres sur un film de paraffine (3 x 3 cm2) dans une parabole vide de 100 mm et retirez soigneusement autant de milieu restant que possible.
- Ajoutez une goutte (7 μL) de matrice EHS sur chaque neurosphère.
- Incuber les gouttes de matrice EHS avec les neurosphères pendant 15 min dans un incubateur.
- Lavez soigneusement les neurosphères du film de paraffine en les rinçant avec un milieu de neurosphère. Pour rincer, utilisez une micropipette de 1 mL et une nouvelle boîte de Pétri de 100 mm contenant 10 mL de milieu neurosphérique.
- Incuber les neurosphères pendant les 4 prochains jours et ajouter 2 ml de milieu neurosphérique frais le jour 2.
note: Assurez-vous que les étagères de l’incubateur sont plates afin que les neurosphères intégrées à la matrice EHS ne s’agglutinent pas d’un côté de la parabole.
3. Organoïdes dans une culture en suspension rotative (14 jours)
- Préparez le milieu organoïde cérébral en mélangeant les éléments suivants : mélange 1:1 de DMEM/F12 et de milieu C (v/v), supplément 1:200 (v/v) 1, supplément 1:100 (v/v) 2 sans vitamine A, 1:100 L-glutamine, 0,05 mM de MEM, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 1,6 g/L d’insuline, 0,5 μM de dorsomorphine, 5 μM de SB431542, et 0,05 mM β-mercaptoéthanol.
- Ajoutez 100 ml de milieu organoïde cérébral dans chaque fiole tournante à travers ses bras latéraux et placez-les dans un incubateur pour les préchauffer pendant au moins 20 minutes.
- Configurez un programme d'agitation à 25 tr/min, selon les instructions du fabricant.
note: Avant de transférer les neurosphères intégrées à la matrice EHS dans des flacons tournants, assurez-vous qu’ils sont tous séparés. Si deux ou plusieurs sont connectés par la matrice EHS, séparez-les en coupant la matrice de connexion avec un scalpel.
- Transférez soigneusement les neurosphères intégrées à la matrice EHS dans des flacons tournants contenant 100 ml de milieu organoïde à l’aide d’une pipette sérologique de 2 ml. Utilisez les bras latéraux de la fiole tournante pour transférer les neurosphères dans la fiole.
- Placer les fioles tournantes sur une plate-forme d’agitation magnétique dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 ; c’est le jour 0 de la culture organoïde.
- Changez de milieu une fois par semaine (ou plus souvent lorsqu’il y a un changement de couleur) en retirant la moitié du milieu et en ajoutant la même quantité de milieu frais.
note: Lorsque vous sortez les flacons tournants de l’incubateur, attendez 3 à 5 minutes pour laisser les organoïdes couler au fond du flacon. Retirez le fluide en plaçant l’embout de pipette en verre (relié à une pompe) à la surface du liquide ; Aspirez soigneusement le fluide par une ouverture latérale ou un bras de la fiole. Ces manipulations doivent se faire sous le capot laminaire.