Différenciation induite par stimulation électrique des cellules souches neurales et progénitrices

Résumé

Source : Chang, H. et al., Différenciation des cellules précurseurs neurales induite par champ électrique dans les dispositifs microfluidiques.J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo montre l’utilisation d’une puce microfluidique recouverte d’une matrice extracellulaire pour différencier les cellules souches neurales et les cellules progénitrices ou NPC par stimulation électrique. Après l’ensemencement et l’adhérence à la région enrobée, les NPC se développent, et l’application d’un courant continu déclenche leur différenciation en neurones, astrocytes et oligodendrocytes.

Protocole

1. Conception et fabrication de la puce électrotaxique multivoie, optiquement transparente (MOE)

1. Dessinez des motifs pour les couches individuelles de polyméthacrylate de méthyle (PMMA) et le ruban adhésif double face à l’aide d’un logiciel approprié (figure 1A, tableau des matériaux). Coupez les feuilles de PMMA et le ruban adhésif double face à l’aide d’un traceur laser CO₂ (Figure 1B).
   1. Allumez le traceur laser CO₂ et connectez-le à un ordinateur personnel. Ouvrez le fichier de motif conçu à l’aide du logiciel.
   2. Placez les feuilles de PMMA (275 mm x 400 mm) ou le ruban adhésif double face (210 mm x 297 mm) sur la plate-forme du traceur laser (Figure 2A). Focalisez le laser sur la surface des feuilles de PMMA ou du ruban adhésif double face à l’aide de l’outil de mise au point automatique.
   3. Sélectionnez le traceur laser comme imprimante, puis « imprimez » le motif à l’aide du traceur laser pour démarrer l’ablation directe sur la feuille de PMMA ou le ruban adhésif double face et obtenir des motifs individuels sur la feuille ou le ruban de PMMA (Figure 2B).
2. Retirez le film protecteur des feuilles de PMMA et nettoyez la surface à l’azote gazeux.
   note: Le dessin du modèle PMMA et l’usinage direct de la feuille de PMMA ont été effectués selon un rapport précédent.
3. Pour coller ensemble plusieurs couches de feuilles de PMMA, empilez trois morceaux de feuilles de PMMA de 1 mm (couches 1, 2 et 3) et collez-les sous une pression de 5 kg/cm² dans une soudeuse thermique pendant 30 min à 110 °C pour former l’ensemble de canal d’écoulement/stimulation électrique (Figure 2C).
   note: Différents lots de feuilles de PMMA obtenues dans le commerce ont des températures de transition vitreuse (Tg) légèrement différentes. La température de collage optimale doit être testée par incréments de 5 °C à proximité de la Tg.
4. Collez 12 pièces d’adaptateur aux ouvertures individuelles de la couche 1 de l’ensemble de puces MOE avec de la colle cyanoacrylate à action rapide.
   note: Les adaptateurs sont fabriqués en PMMA par moulage par injection. Les surfaces planes en bas servent à se connecter à la puce MOE. Les adaptateurs portant des filetages femelles 1/4W-28 sont destinés à connecter des bouchons blancs étanches à la main, des connecteurs à fond plat ou des adaptateurs Luer. Soyez prudent lorsque vous utilisez de la colle cyanoacrylate à action rapide. Évitez d’éclabousser les yeux.
5. Désinfectez les substrats en PMMA de 1 mm (couches 1 à 3), le ruban adhésif double face (couche 4) et le PMMA de qualité optique de 3 mm (couche 5) à l’aide d’une irradiation ultraviolette (UV) pendant 30 minutes avant d’assembler la puce (Figure 1A).
6. Collez les substrats PMMA de 1 mm (couches 1 à 3) sur le PMMA de qualité optique de 3 mm (couche 5) avec le ruban adhésif double face (couche 4) pour terminer l’assemblage du PMMA (couches 1 à 5) (Figure 1A).
7. Préparez le verre de protection propre pour l’assemblage sur la puce.
   1. Remplissez une dilution dix fois plus importante du détergent dans un pot de coloration (voir le tableau des matériaux) et nettoyez le verre de couverture de ce détergent à l’aide d’un nettoyeur à ultrasons pendant 15 min.
   2. Rincez abondamment le pot de teinture sous l’eau courante du robinet pour éliminer toute trace de détergent.
   3. Continuez à rincer à l’eau distillée pour éliminer toute trace d’eau du robinet et répétez l’étape 1.7.2 deux fois.
   4. Séchez le verre de protection nettoyé en le soufflant avec de l’azote gazeux.
8. Désinfectez l’assemblage en PMMA (couches 1 à 5), le ruban adhésif double face (couche 6) et le verre de protection (couche 7) à l’aide d’un rayonnement UV à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité pendant 30 minutes avant d’assembler la puce (figure 1A).
9. Collez le verre de protection nettoyé (couche 7) sur l’assemblage PMMA (couches 1 à 5) avec le ruban adhésif double face (couche 6) (Figure 1A).
10. Incuber la puce MOE dans une chambre à vide pendant la nuit ; utiliser l’ensemble de puces MOE pour les procédures subséquentes (figure 3).

2. Enrobage de poly-L-lysine (PLL) sur le substrat dans les régions de culture cellulaire

1. Préparez le tube en polytétrafluoroéthylène, le connecteur à fond plat, le connecteur conique, l’adaptateur cone-Luer, le bouchon blanc étanche au doigt (également appelé bouchon), l’adaptateur Luer, la seringue Luer lock et le bouchon en caoutchouc noir (Figure 4A, tableau des matériaux). Stérilisez tous les composants ci-dessus dans un autoclave à 121 °C pendant 30 min.
2. Scellez les ouvertures des adaptateurs de pont en gélose (Figure 1A) avec les bouchons blancs étanches à la main. Connectez le connecteur à fond plat à l’ensemble de puce MOE via les adaptateurs d’entrée et de sortie du fluide (Figure 4B). Connectez l’adaptateur cone-Luer aux robinets d’arrêt à 3 voies.
3. Ajouter 2 mL de solution de PLL à 0,01 % à l’aide d’une seringue de 3 mL qui se connecte au robinet d’arrêt à 3 voies de l’entrée du fluide (Figure 4B-3. Préparation du réseau de ponts salins
   1. Après l’étape 2.6, ouvrez les deux robinets d’arrêt à 3 voies et rincez les bulles dans les canaux en pompant manuellement la solution d’enrobage d’avant en arrière dans le canal à l’aide des deux seringues.
   2. Prélever 3 mL de milieu complet (milieu d'entretien des cellules souches composé du milieu d'Eagle modifié de Dulbecco/mélange nutritif de Ham F-12 (DMEM/F12), d'un supplément de B-27 à 2 %, de 20 ng/mL d'EGF et de 20 ng/mL de bFGF) dans une seringue de 3 mL qui se connecte au robinet d'arrêt à 3 voies de l'entrée du milieu (Figure 4B-4. Préparation des mNPCs
      1. Cultivez les mNPC dans le milieu complet dans un flacon de culture cellulaire de 25T à 37 °C dans un incubateur rempli d’une atmosphère à 5 % de CO₂. Sous-cultivez les cellules tous les 3-4 jours et effectuez toutes les expériences avec des cellules qui ont subi 3 à 8 passages de la source d’origine.
      2. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL et faites tourner les neurosphères à 100 × g pendant 5 min. Aspirez le surnageant et lavez les neurosphères avec 1x PBS de Dulbecco (DPBS). Faites tourner les neurosphères à 100 × g pendant 5 min.
      3. Aspirez le 1x DPBS, puis remettez en suspension les neurosphères dans le milieu complet. Mélangez soigneusement et doucement.
      4. Ajouter 1 mL de suspension de la neurosphère à l’aide d’une seringue de 1 mL qui se connecte au robinet d’arrêt à 3 voies de la sortie (Figure 4B-5. Configuration du système microfluidique pour la stimulation par impulsions DC (Figure 6)
         1. Installez la puce MOE à ensemencement cellulaire sur le réchauffeur transparent à l’oxyde d’indium-étain (ITO) fixé sur une platine motorisée X-Y-Z programmable.
            note: La température de surface de l’ITO est contrôlée par un contrôleur proportionnel-intégral-dérivé et maintenue à 37 °C. Un thermocouple de type K est fixé entre la puce et l’élément chauffant ITO pour surveiller la température des régions de culture cellulaire à l’intérieur de la puce. La puce MOE est installée sur une platine motorisée X-Y-Z programmable et convient à l’acquisition automatique d’images en accéléré sur des sections de canaux individuels. La fabrication de l’appareil de chauffage ITO et la mise en place du système de chauffage de culture cellulaire ont été décrites précédemment.
         2. Infuser les mNPC en les pompant manuellement dans la puce MOE via la sortie du fluide. Incuber la puce MOE enracinée dans les cellules sur le réchauffeur ITO à 37 °C pendant 4 h.
         3. Après 4 h, pomper l’ensemble du fluide à travers la puce MOE via l’entrée du fluide à un débit de 20 μL/h à l’aide d’une pompe à seringue.
            note: Les mNPC sont cultivés et maintenus dans la puce pendant 24 heures supplémentaires avant d’être stimulés par des champs électriques (EF) pour permettre l’attachement et la croissance des cellules. Les déchets liquides sont collectés dans une seringue vide de 5 mL reliée au robinet d’arrêt à 3 voies de la sortie, représenté par « déchets » à la figure 6A. La configuration du système microfluidique MOE est illustrée à la figure 6. Ce système microfluidique fournit un apport continu de nutrition aux cellules. L’ensemble du milieu frais est pompé en continu dans la puce MOE pour maintenir une valeur de pH constante. Par conséquent, les cellules peuvent être cultivées à l’extérieur d’un incubateur de CO₂.
         4. Utilisez des fils électriques pour connecter un multiplexeur EF à la puce MOE via les électrodes Ag/AgCl de la puce. Connectez un multiplexeur EF et un générateur de fonctions à un amplificateur pour produire des impulsions CC à ondes carrées d’une amplitude de 300 mV/mm à une fréquence de 100 Hz à 50 % de rapports cycliques (50 % de temps de fonctionnement et 50 % de temps d’arrêt) (Figure 6B).
            1. Connectez les fils électriques au multiplexeur EF. Connectez les fils électriques à la puce MOE via les électrodes Ag/AgCl.
            2. Connectez le multiplexeur EF à l’amplificateur à l’aide de fils électriques. Connectez le générateur de fonctions à l’amplificateur et à l’oscilloscope numérique.
               note: Le multiplexeur EF est un circuit qui inclut l’impédance de la chambre de culture dans le circuit et relie toutes les chambres individuelles dans un réseau électronique parallèle. Chacune des trois chambres de culture est connectée électriquement en série à une résistance variable (Vr) et à un ampèremètre (représenté par μA sur la figure 6A) dans le multiplexeur. Le courant électrique à travers chaque chambre de culture est modifié en contrôlant le Vr, et le courant est indiqué sur l’ampèremètre correspondant. L'intensité du champ électrique dans chaque région de culture cellulaire a été calculée par la loi d'Ohm, I = σEA, où I est le courant électrique, σ (fixé à 1,38 S·^m-1 pour DMEM/F12) est la conductivité électrique du milieu de culture, E est le champ électrique et A est la section transversale de la chambre électrotactique. Pour la dimension de la région de culture cellulaire illustrée à la figure 1, le courant électrique est de ~87 mA et de ~44 mA pour le courant continu et l’impulsion CC à 50 % du rapport cyclique, respectivement.
         5. Soumettez les mNPC à des impulsions CC carrées d’une amplitude de 300 mV/mm à la fréquence de 100 Hz pendant 48 h. Pompez en continu le milieu complet à un débit de 10 μL/h pour fournir une nutrition adéquate aux cellules et maintenir une valeur de pH constante dans le milieu.

Résultats

Figure 1 : La configuration détaillée de la puce électrotaxique multicanal optiquement transparente.(A) Vue éclatée de l’ensemble de puces MOE. La puce MOE se compose de feuilles de PMMA (50 mm x 25 mm x 1 mm), de ruban adhésif double face (50 mm x 25 mm x 0,07 mm), d’adaptateurs (10 mm x 10 mm x 6 mm), de feuilles de PMMA de qualité optique (50 mm x 75 mm x 3 mm), de ruban ad...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Substrats PMMA de 1 mm (couches 1-3)	Bht	K2R20	Polyméthacrylate de méthyle (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
Tube en plastique de 15 mL	Protech Technology Enterprise Co., Ltd	CT-15-PL-TW	Tube à fond conique avec bouchon, assemblé, pré-stérilisé
Seringue de 3 mL	TERUMO	DVR-3413	Seringues orales de 3 ml, sans aiguille
PMMA de qualité optique 3 mm (couche 5)	Société CHI MEI	Feuille de PMMA ACRYPOLY	PMMA de qualité optique
Robinet d’arrêt à 3 voies	NIPRO	NCN-3L	Robinet d’arrêt stérile jetable à 3 voies
Seringue de 5 ml	TERUMO	DVR-3410	Seringues orales de 5 ml, sans aiguille
adaptateur	Dong Zhong Co., Ltd.	Personnalisé	Adaptateur PMMA
Agarose	Sigma-Aldrich	A9414	Agarose, basse température de gélification
amplificateur	A.A. Lab Systems Ltd	A-304	Amplificateur haute tension
Logiciel AutoCAD	Autocar	Version éducative	Rédaction
Supplément B-27	Gibco	Référence 12587-010	Supplément de B-27 (50x), moins vitamine A
Facteur de croissance des fibroblastes de base (bFGF)	Peprotech	AF-100-18B	Aussi appelé FGF-basic humain recombinant
Bonde en caoutchouc noir	TERUMO	DVR-3413	À partir de seringues orales de 3 mL, sans aiguille
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	Réf. B4287	Réactif de blocage
centrifugeuse	HSIANGTAI	CV2060	centrifugeuse
Traceur laser CO2	Laser Tools et Technics Corp.	ILS-II	Acheté chez http://www.lttcorp.com/index.htm
Connecteur conique	IDEX Santé et science	F-120X	Cône unibloc 10-32, pour 1/16" OD naturel
Adaptateur Cone-Luer	IDEX Santé et science	P-659	Adaptateur Luer 10-32 Femelle vers Luer Femelle, PEEK
Microscope confocal à fluorescence	Microsystèmes Leica	TCS SP5	Manuel d’utilisation du Leica TCS SP5, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
appareil photo numérique	Olympe	E-330	Acquisition automatique d’images en accéléré
Oscilloscope numérique	Tektronix	TDS2024	Mesurez des signaux de tension ou de courant au fil du temps dans un circuit ou un composant électronique pour afficher l’amplitude et la fréquence.
Ruban adhésif double face	3m	PET 8018	Acheté chez http://en.thd.com.tw/
Milieu Eagle's modifié/mélange nutritif de Ham F-12 de Dulbecco (DMEM/F12)	Gibco	12400024	DMEM/F-12, poudre, HEPES
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)	Gibco	21600010	DPBS, poudre, sans calcium, sans magnésium
Multiplexeur EF	Asiatic Sky Co., Ltd.	Personnalisé	Surveiller et contrôler le courant électrique dans les différentes voies
Facteur de croissance épidermique (EGF)	Peprotech	AF-100-15	Aussi appelé EGF humain recombinant
Colle cyanoacrylate à action rapide	3m	7004T	Résistance de l’adhésif instantané (liquide)
Connecteur à fond plat	IDEX Santé et science	P-206	Écrou mâle sans bride Delrin, 1/4-28 à fond plat, pour 1/16" OD bleu
Générateur de fonctions	Agilent Technologies	Référence 33120A	Générateur de fonctions synthétisées hautes performances de 15 MHz avec capacité de forme d’onde arbitraire intégrée
Verre à l’indium-étain-oxyde (ITO)	Merck	300739	Pour chauffage ITO
Thermocouple de type K	Tecpel	TPK-02A	Thermocouples de température
Adaptateur Luer	IDEX Santé et science	N° P618-01	Adaptateur Luer femelle Luer vers polypropylène 1/4-28 mâle
Seringue Luer Lock	TERUMO	DVR-3413	Pour les ponts de sel d’agar
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Assurance-vie de base	Réf. BL2651	Solution de lavage
Poly-L-lysine (PLL)	sigma	Réf. P4707	Solution de revêtement
Verres de protection de précision épaisseur n° 1,5H	MARIENFELD	107242	https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
Platine motorisée programmable X-Y-Z	Tanlian Inc	Personnalisé	Acheté chez http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
Contrôleur proportionnel-intégral-dérivé (PID)	Toho Electronics	TTM-J4-R-AB	Régulateur de température
Tube en PTFE	Professional Plastics Inc. Succursale de Taïwan	Diamètre extérieur 1/16 pouces	Tube en PTFE translucide blanc
Pousse-seringue	Systèmes New Era Inc	NE-1000	Pousse-seringue unique programmable NE-1000
Détergent TFD4	FRANCLAB	TFD4	Nettoyant pour vitres Cover
Thermocolleuse	Kuan-MIN Tech Co.	Personnalisé	Acheté chez http://kmtco.com.tw/
Nettoyeur à ultrasons	Lion	LEO-300S	Nettoyeur de stéri à ultrasons
Chambre à vide	DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd.	Diamètre de l’écran 30	Four de séchage sous vide
Bouchon étanche blanc	IDEX Santé et science	P-316	1/4-28 à fond plat, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html