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Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
La figure 1 illustre une vue d’ensemble schématique du flux de travail de ce protocole.
1. Reprogrammation et maintenance de l’iPSC
- Prélever 8 ml du sang du sujet (âgé ou malade, âgé de 65 ans et plus) dans des tubes de préparation cellulaire (CPT) avec du citrate de sodium ou dans de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) ou des tubes héparinisés.
- Centrifuger à 1 800 x g pendant 30 min à température ambiante (RT) pour prélever les granules contenant uniquement du sang périphérique et aucun sérum.
- Utilisez des vecteurs de reprogrammation spécialisés selon le protocole du fabricant (voir Tableau des matériaux) pour obtenir des iPSC.
- Cultiver des iPSC dans des plaques de culture à 6 puits recouvertes d’une matrice de culture à 6 puits sans virus élévateur de lactose déshydrogénase (LDEV), sans virus élévateur de lactose déshydrogénase (LDEV), à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2.
- Maintenir les CSPi dans les milieux E8 pendant 3 à 4 jours afin d’éviter l’encombrement ou la différenciation spontanée.
- Valider la pluripotence des lignées iPSC à l’aide de marqueurs immunofluorescents (étape 2) et tester le mycoplasme (étape 3).
2. Coloration de la pluripotence
- Pour conserver les solutions et les anticorps, ensemencez les cellules sur des plaques de culture enrobées (étape 1.4) à 24 puits 3 à 4 jours avant l’analyse. Aspirez le milieu à l’aide d’une pipette et fixez les cellules avec 4 % de formaldéhyde dans une solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS) pendant 15 à 20 minutes à RT.
- Laver les cellules 3 fois avec 1x PBS et perméabiliser avec 0,1 % de Triton-X 100 dans 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS pendant au moins 15 min, mais pas plus de 1 h à RT.
- Laver 3 fois avec 1x PBS et bloquer avec 5 % de BSA dans PBS pendant 30 min à RT.
- Laver à nouveau 3 fois avec 1x PBS et ajouter les anticorps Sox2 et Oct3/4 (dilution 1:100 ; voir tableau des matériaux), et le colorant nucléique DAPI dans 1 % BSA (dilution 1:4 000) pendant la nuit à 4 °C . Enveloppez-le dans du papier d’aluminium pour le protéger de la lumière.
- Lavez 3 fois avec 1 PBS et laissez les cellules dans du PBS. Image avec un microscope à fluorescence à un grossissement de 10-20x. Assurez-vous que les marqueurs de pluripotence déterminant le sexe de la région Y-box 2 (Sox2) et le facteur de transcription de liaison à l’octamère 3/4 (Oct3/4) sont localisés dans les noyaux des cellules.
3. Test des mycoplasmes
REMARQUE : Reportez-vous au protocole du kit de détection (voir Tableau des matériaux) pour les étapes détaillées d'exécution et d'analyse du test. Le kit de détection fournit le réactif, le substrat et le tampon de dosage pour l’analyse des mycoplasmes.
- Avant de passer les cellules ou le milieu de rafraîchissement, prélever 2 à 3 mL de milieu de culture cellulaire dans un tube à centrifuger et granuler les cellules ou les débris à 200 x g pendant 5 min à RT. Conserver le surnageant à 4 °C pendant ≤5 jours. Incuber les cellules avec le milieu pendant au moins 24 h pour assurer un signal détectable.
- Ajouter 100 μL de surnageant cellulaire dans un tube frais ou un puits d’une plaque à paroi blanche de 96 puits (fond opaque recommandé, voir le tableau des matériaux). Reconstituer le réactif et le substrat dans le tampon de dosage et équilibrer pendant 15 min à RT.
- Ajouter 100 μL du réactif à l’échantillon et incuber pendant 5 min à RT. Mesurer la luminescence avec un luminomètre (mesure #1).
- Ajouter 100 μL du substrat à l’échantillon et incuber pendant 10 min à RT. Mesurer la luminescence (mesure #2).
- Déterminer la contamination par les mycoplasmes par le rapport entre la mesure #2 et #1. Reportez-vous au manuel du kit pour l'interprétation des résultats.
4. Préparation des microfilaments
- Commencez la préparation des microfilaments de poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA, voir Tableau des matériaux) en effilochant le brin de suture avec l’extrémité émoussée d’un scalpel. Stérilisez légèrement la fibre effilochée avec de l’éthanol à 70 %.
- Au microscope et à l’aide d’une règle, commencez à couper la fibre PLGA en fragments de brins de 500 μm à 1 mm de long. Coupez environ 25 mm de la fibre au total. Conservez les filaments dans un tube de 15 ml avec une solution antibiotique-antimycosique de 1 ml.
- Dans la hotte, diluer la solution de fibres avec 10 mL de DMEM/F-12 (tableau 1). Bien vortex pour mélanger la solution.
note: Travail dans une hotte de culture cellulaire dans un environnement stérile.
- Ajouter 20 μL de la solution de fibres à trois corps embryoïdes formant des puits d’une plaque de 96 puits. Sous microscopie à fond clair, comptez et faites la moyenne des fibres par puits. Diluez ou concentrez pour obtenir en moyenne 5 à 10 microfilaments PLGA par puits. Préparez chaque puits de cette manière.
- Les puits sont maintenant prêts à être ensemencés avec des cellules. Conservez la plaque à température ambiante jusqu’à ce que vous en ayez besoin ou à 4 °C le lendemain.
5. Formation du corps embryoïde (EB)
REMARQUE : Tous les supports et solutions doivent être chauffés en RT.
- Une fois que les iPSC ont atteint une confluence de 70 % à 80 % (Figure 2A), ils sont prêts à être passés et utilisés pour la formation d’EB. Vérifiez les cellules avec un microscope à un grossissement de 10x-20x. S’assurer que les colonies présentent des zones minimales (<10 %) de différenciation spontanée.
- Aspirez le milieu à l'aide d'une pipette et lavez les cellules une fois avec la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS). Dissocier les colonies en ajoutant 500 μL de solution de détachement cellulaire (voir le tableau des matériaux) ou 0,5 mM d’EDTA et incuber pendant 3 à 5 min à 37 °C
note: Travail dans une hotte de culture cellulaire dans un environnement stérile.
- Prélevez les cellules libérées en ajoutant 1 mL de milieu E8 frais dans chaque puits et pipetez doucement jusqu’à ce que toutes les cellules soient détachées.
- Transférez 1,5 mL de suspension cellulaire dans un tube de 15 mL et ajoutez 1 mL de milieu E8 frais pour atteindre un volume total de 2,5 mL.
- Centrifugeuse à 290 x g pendant 3 min à RT.
- Aspirez le surnageant à l’aide d’une pipette, remettez en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu Essential 6 (E6, voir tableau des matières) complété par 50 μM d’inhibiteur de la protéine kinase associée à Rho (ROCK), et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Préparer une suspension cellulaire de 60 000 à 90 000 cellules/mL, selon la densité de semis souhaitée, dans un milieu E6 complété par 50 μM d’inhibiteur de ROCK (voir le tableau des matériaux).
- Ajouter 150 μL de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque à fixation ultra-faible (ULA) de 96 puits (ou d’une plaque concave préparée). Ensemencer 9 000 à 11 000 cellules par puits.
- Centrifuger la plaque pour forcer l’agrégation des cellules à 290 x g pendant 1 min à RT. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2.
6. Induction neuroépithéliale
- Après 24 h, aspirez soigneusement 120 μL du milieu à l’aide d’une pipette. Assurez-vous de ne pas aspirer l’EB en abaissant la pointe de la pipette trop loin dans le puits.
- Ajouter 150 μL de milieu E6 (à RT) complété par 2 μM de XAV939 et le suppresseur des mères contre les inhibiteurs décapentaplégiques (SMAD) : 10 μM de SB431542 et 500 nM de LDN 193189 par puits (voir tableau des matériaux).
- Changez de milieu tous les jours avec un milieu E6 fraîchement préparé complété par 2 μM de XAV939, 10 μM de SB431542 et 500 nM de LDN 193189.
note: Au jour 6 (DIV6), les EB devraient avoir un diamètre de 550 à 600 μm et être prêts pour une différenciation supplémentaire.
7. Différenciation et maturation des organoïdes
REMARQUE : Tous les supports doivent être chauffés en RT.
- À environ DIV7, vérifiez si tous les EB ont atteint un diamètre de 550-600 μm et présentent un bord lisse et clair (Figure 2B) ; à ce stade, ils sont prêts à être intégrés dans une matrice extracellulaire (ECM).
note: Travaillez dans un environnement stérile.
- Préparez des feuilles d’enrobage alvéolées à partir du film d’étanchéité thermoplastique (voir le tableau des matériaux) en plaçant une feuille de film (environ 4 pouces de long) sur une boîte P200 vide. À l’aide d’un tube conique de 15 ml ou d’un tube de microcentrifugation de 500 μL, enfoncez doucement la feuille de film dans les trous pour former 12 fossettes. Vaporisez la feuille de film avec de l’éthanol à 70 % et laissez-la sécher à l’intérieur de la hotte d’écoulement avec la lumière UV allumée pendant au moins 30 min.
- Décongelez une quantité suffisante de matrice de membrane basale (Matrigel, voir Tableau des matériaux) sur de la glace et placez-la à l’intérieur de la hotte d’écoulement.
note: Par EB, environ 30 μL de matrice membranaire non diluée sont nécessaires. Gardez toujours la matrice membranaire en dessous de 4 °C pour éviter qu’elle ne gélifie. Les pointes de pipette pré-refroidies sont également recommandées car elles ralentissent la polymérisation de la matrice dans la pointe pendant le pipetage, réduisant ainsi les pertes de matière.
- À l’aide d’une pointe P200 à alésage large, transférez un EB sur chaque fossette et retirez autant de support que possible avec une pointe de pipette normale. Faites attention à ne pas laisser sécher les EB. À l’aide d’une pointe P200 régulière, ajoutez ~30 μL de matrice membranaire non diluée à chaque organoïde, en veillant à ce que l’EB soit au centre de la gouttelette.
- Une fois que tous les EB sont intégrés dans la matrice, placez la feuille de film contenant les EB dans une boîte de Pétri stérile.
note: En option, une petite boîte de Pétri remplie d’eau stérile peut être placée dans la boîte de Pétri plus grande à côté de la feuille de film pour éviter l’évaporation.
- Transférez la parabole dans un incubateur et incubez à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2 pendant environ 10 min pour laisser la matrice membranaire se solidifier.
- Pour chaque ensemble de 12 organoïdes intégrés, préparer 5 mL de milieux de différenciation avec de la vitamine B27 sans vitamine A (tableau 1) dans un puits d’une plaque ULA à 6 puits. Préchauffez la plaque à 37 °C dans un incubateur.
- Une fois le temps d’incubation terminé, transférez les EB intégrés sur la plaque ULA à 6 puits en prenant la feuille de film et en repoussant les fossettes à l’arrière de la feuille. Si nécessaire, prélever 1 mL du puits et le pipeter sur la feuille pour aider les gouttelettes à se détacher du film.
note: D’importants changements morphologiques peuvent être observés 1 jour après l’enrobage ; Les EB passent d’un bord lisse à des protubérances bombées formant des bourgeons (Figure 2C).
- Après 2 jours (DIV9), effectuez un changement de demi-support. Veillez à ne pas aspirer ou endommager les gouttelettes de la matrice membranaire au cours du processus.
- Après 2 jours supplémentaires (DIV11), effectuez un changement complet de support, en complétant le support avec 3 μM de CHIR99021 (voir tableau des matériaux).
- À la DIV14, changer le milieu pour un milieu de différenciation avec de la B27 avec de la vitamine A (Tableau 1) pour une augmentation progressive de la taille des organoïdes.
- À DIV16, placez la plaque de puits sur un agitateur orbital à 90 tr/min à l’intérieur d’un incubateur. Changez de support tous les 2 jours.
- Tous les 40 DIV, diluer 500 μL de la matrice membranaire pour chaque 50 mL de milieu afin d’obtenir des nutriments supplémentaires dans le milieu.
Tableau 1 : Composition des milieux de différenciation utilisés dans la présente étude.
| Réactif | Concentration finale | Contenance (50 mL au total) |
| DMEM-F12 | 50 % | 25 ml |
| Milieu neurobasal | 50 % | 25 ml |
| Supplément N2 (100x) | 1x | 0,25 mL |
| Supplément B27 -/+ Vitamine A (50x) | 0,5 fois | 0,5 mL |
| insuline | 0,25 % | 12,5 μL |
| GlutaMAX (100x) | 1x | 0,5 mL |
| MEM-NEAA (100x) | 0,5 fois | 0,25 mL |
| HEPES (1 M) | 10 millions d’euros | 0,5 mL |
| Antibiotique/antimycosique (100x) | 1x | 0,5 mL |
| 2-β-mercaptoéthanol | 50 μM | 17,5 μL |
| REMARQUE : certains DMEM-F12 contiennent déjà du GlutaMAX, pas besoin d’en ajouter d’autres. |
