Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
Tous les réactifs et équipements utilisés dans ce protocole sont répertoriés dans la Table des matériaux et doivent être utilisés stériles. Le support doit être chauffé à température ambiante (RT) avant utilisation, sauf indication contraire. Pour un aperçu du protocole de co-culture, veuillez consulter la figure 1.
1. Différenciation des progéniteurs des motoneurones à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPSC)
- Suivez le protocole de différenciation des motoneurones, adapté d’une étude précédente, jusqu’à ce que vous atteigniez l’état de progéniteur neural (NPC) du jour 10. Selon la chronologie du protocole, la différenciation est initiée un lundi (jour 0), ce qui se traduit par des PNJ du jour 10 un jeudi.
- Cryopreserve jour 10 NPC en remplacement sérique knock-out avec 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) à une densité de 2 x 106- 4 x 106 cellules par flacon.
prudence: Le DMSO est toxique : manipuler dans une hotte avec un équipement de protection individuelle.
REMARQUE : Environ 50 % de la journée, les 10 PNJ devraient être vitaux lors de la décongélation. Arrêtez le protocole de différenciation des motoneurones à cet état de « NPC du jour 10 » et cryoconservez les NPC pour générer un grand nombre de NPC, qui peuvent être mis en banque et utilisés plus tard, réduisant ainsi la durée de la chronologie globale du protocole de co-culture de 28 jours à 19 jours au total.
2. Dérivation et maintenance des mésoangioblastes humains (MABs)
REMARQUE : Les anticorps monoclonaux sont des cellules souches mésenchymateuses associées aux vaisseaux, qui dans ce cas ont été prélevées à partir de biopsies obtenues sur un donneur sain de 58 ans. D’autres sources commerciales sont disponibles. Le protocole d’obtention des anticorps monoagres est brièvement expliqué. Pour plus d’informations, reportez-vous au protocole détaillé. Tous les supports MAB doivent être chauffés à 37 °C avant utilisation.
- Émincez le tissu de biopsie et incubez sur des boîtes de collagène (à partir de peau de veau) enrobées de 6 cm dans un milieu de croissance (tableau 1) pendant 2 semaines. Changez de support tous les 4 jours.
- Pour préparer l’enrobage de collagène, dissolvez 100 mg de collagène dans 20 ml d’acide acétique 0,1 M. Le collagène met du temps à se dissoudre, alors placez le mélange sur une plate-forme à bascule pendant la nuit à RT. Le lendemain, compléter avec 80 mL de ddH2O jusqu’à un volume final de 100 mL.
prudence: L’acide acétique est toxique ; Poignée dans une hotte avec équipement de protection individuelle.
note: Le collagène du revêtement en cuir de veau peut être réutilisé jusqu’à 5 fois. Conserver à 4 °C.
- Enduire toute la surface du plat ou de la fiole de collagène, fermer et incuber pendant 20 min à RT à l’intérieur d’un flux laminaire. Après 20 min, récupérez le collagène dans un récipient frais, fermez le plat/flacon vide et laissez reposer 10 min à RT dans le flux laminaire.
- Transvaser le plat ou le ballon dans l’incubateur pour une incubation d’une nuit (ou d’au moins 6 h) (37 °C, 5 % de CO2). Lavez 5 fois avec la solution saline tamponnée au phosphate sans calcium ni magnésium (DPBS) de Dulbecco avant de plaquer les cellules.
- Après 14 jours, le FACS (tri cellulaire activé par fluorescence) trie les MAB pour la phosphatase alcaline humaine, suivi d’une expansion supplémentaire. Maintenir les anticorps monoclonaux sur des flacons T75 enrobés de collagène dans le milieu de croissance et changer le milieu de croissance tous les 2 jours (10 ml par ballon).
- Cryoconserver, passer ou semer des MAB dans des dispositifs lorsque la confluence atteint 70 %.
note: Les MAB perdent leur potentiel myogénique en raison de fusions spontanées au contact de cellule à cellule. Assurez-vous de ne pas dépasser 70 % de confluence lors de l’expansion des MAB. Une fiole T75 confluente à 70 % contient environ 600 000 à 800 000 cellules, qui peuvent être cryoconservées à raison de 100 000 cellules par flacon. Chaque flacon peut ensuite être décongelé et ensemencé dans un ballon T75 pour l’expansion.
- Pour faire passer les MAB, lavez-les délicatement une fois avec 7 mL de DPBS puis incubez dans 7 mL de solution de dissociation MAB pendant 3 min à 37 °C dans 5 % de CO2 pour dissocier les cellules.
- Neutralisez la solution de dissociation de l’ABM avec 7 ml de milieu de croissance, grattez doucement les cellules et transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 50 ml. Lavez délicatement le ballon avec 5 ml supplémentaires de milieu de culture pour recueillir les MAB restants.
- Centrifuger la suspension cellulaire pendant 3 min à 300 x g, puis passer directement dans un nouveau ballon T75 enduit de collagène pour l’expansion, cryoconserver en remplacement du sérum knock-out avec 10 % de DMSO ou compter pour ensemencer dans un dispositif microfluidique.
REMARQUE : Les passages sont effectués 1x-2x par semaine pour l’expansion cellulaire jusqu’à un nombre maximum de passages de 13. Lors de la dissociation, les anticorps monoformes apparaissent sphériques et de grande taille lorsqu’ils sont examinés au microscope.
3. Préparation des dispositifs microfluidiques pré-assemblés - Jour 9
REMARQUE : Le protocole est adapté du protocole de dispositif neuronal du fabricant du dispositif microfluidique et a été ajusté pour l'utilisation de dispositifs pré-assemblés et en silicone. Ici, des dispositifs pré-assemblés sont utilisés pour l’immunocytochimie (ICC) et les enregistrements transitoires de calcium sur cellules vivantes, tandis que les dispositifs en silicone sont utilisés pour la microscopie électronique à balayage (MEB). La chronologie du protocole suit la chronologie du protocole de différenciation des motoneurones.
- Préparez les dispositifs microfluidiques la veille de l’ensemencement des cellules, car l’enrobage doit incuber pendant la nuit. Selon le protocole du motoneurone, ce sera un mercredi. Ajouter ~10 ml d’éthanol à 70 % à 100 % dans une boîte de Pétri de 10 cm. À l’aide d’une pince, transférez l’appareil du conteneur d’expédition à la boîte de Pétri pour la stérilisation.
- Immergez l’appareil dans de l’éthanol pendant 10 secondes et transférez l’appareil avec une pince sur une feuille de papier pour le faire sécher à l’air libre dans le flux laminaire pendant ~30 min. Retournez l’appareil plusieurs fois pour permettre aux deux côtés de sécher. Lorsque l’appareil est sec, utilisez une pince pour déplacer chaque appareil dans une boîte de Pétri individuelle de 10 cm pour une manipulation facile.
prudence: L’éthanol est toxique ; Poignée dans une hotte avec équipement de protection individuelle
- Enduire l’appareil de Poly-L-ornithine (PLO) (100 μg/mL) dans du DPBS et incuber à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 3 h.
- À l’aide d’une pipette P200, ajoutez 100 μL de PLO dans le DPBS dans un puits supérieur aussi près que possible de l’ouverture du canal et observez le fluide passer du puits supérieur au puits inférieur à travers le canal. Par la suite, ajoutez 100 μL de PLO dans le DPBS dans le puits de fond.
- Répétez l’opération de l’autre côté des microsillons et terminez en ajoutant 100 μL sur un côté de l’appareil pour créer un gradient de volume entre les deux côtés réfléchissants de l’appareil pour recouvrir les microsillons (par exemple, côté droit 200 μL, côté gauche 300 μL). Après 3 h, lavez l’appareil 3x pendant 5 min avec DPBS. Utilisez un système d’aspiration si nécessaire.
note: Assurez-vous d’éviter toute formation de bulles d’air dans les canaux à tout moment pendant l’enrobage ou la culture des cellules. Même les petites bulles se dilatent sur une courte période, inhibant ainsi l’enrobage, l’ensemencement cellulaire ou l’écoulement du fluide à travers le canal. Si le fluide s’arrête dans le canal pendant le revêtement, remettre la solution PLO en suspension directement dans le canal des deux côtés. S’il y a encore des bulles, utilisez 200 μL de DPBS pour rincer le caniveau et répéter le processus de revêtement comme indiqué ci-dessus aux étapes 3.3.1 et 3.3.2. Si des bulles apparaissent après l’ensemencement des cellules, il est impossible de récupérer l’appareil, car le rinçage du canal endommagera les cellules.
- Enduire l’appareil de laminine (20 μg/mL) dans un milieu neurobasal et incuber toute la nuit à 37 °C, 5 % CO2. Suivez les mêmes instructions pour le revêtement PLO des étapes 3.3.1-3.3.2.
- Le lendemain, utilisez une pipette P200 et positionnez l’embout dans le puits à l’opposé de l’ouverture du canal pour retirer le revêtement de laminine des puits. Ajoutez du DPBS à tous les puits et laissez les appareils avec DPBS dans le flux laminaire à RT pour l’ensemencement cellulaire.
REMARQUE : À partir de ce moment, il est important de ne pas retirer de liquide (revêtement de laminine, DPBS, support, solution de fixation, etc.) directement des canaux, car cela pourrait provoquer la formation de bulles d’air. Inspectez toujours les appareils au microscope avant d’ensemencer les cellules.
4. Placage des NPC dans les dispositifs microfluidiques - Jour 10
REMARQUE : Selon le protocole de différenciation des motoneurones, le placage des PNJ du jour 10 a lieu un jeudi.
- Utilisez des NPC du jour 10 fraîchement dissociés, ou décongelez 1 à 2 flacons de NPC mis en banque par 10 mL de milieu motoneuronal du jour 10 (tableau 2 et tableau 3) avec une solution d’inhibiteur de ROCK (10 μL/mL), et centrifugez la suspension cellulaire à 100 x g pendant 4 min.
- Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 500 à 1000 μL de milieu motoneuronale du jour 10 avec une solution inhibitrice de ROCK (10 μL/mL) et compter les cellules vivantes à l’aide de la méthode de comptage de votre choix.
note: Comme indiqué ci-dessous, assurez-vous de remettre les PNJ en suspension dans la bonne quantité de milieu pour s’adapter à un volume de semis optimal.
- Retirez le DPBS de deux puits d’un côté des microsillons du dispositif à l’aide d’une pipette P200 et ensemencez 250 000 NPC par dispositif dans 60 à 100 μL de milieux de motoneurones du jour 10.
- Dans le puits supérieur droit, ensemencez 30 à 50 μL de la suspension cellulaire (125 000 cellules) près de l’ouverture du canal à un angle de 45° et faites glisser doucement le fluide restant le long du fond du puits vers le centre du puits avec la pointe de la pipette.
- Faites une pause de quelques secondes pour permettre à la suspension cellulaire de s’écouler dans le canal avant de répéter cette opération dans le puits inférieur (125 000 cellules dans 30 à 50 μL). Utilisez un stylo pour marquer le côté grainé « NPC » ou équivalent pour une orientation facile de l’appareil sans microscope.
- Incuber l’appareil à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 5 min pour permettre la fixation de la cellule avant de remplir les puits à deux graines avec un milieu supplémentaire de motoneurones du jour 10 (total 200 μL/puits) et incuber à nouveau à 37 °C, 5 % de CO2,
note: Chaque puits peut contenir 200 μL. L’ensemencement des cellules dans les puits et les canaux assure une structure robuste de la culture, réduisant ainsi le risque de détachement cellulaire lors des changements de milieu. Il est possible d’ensemencer moins de cellules dans le seul canal. Cependant, cela rendra la culture plus sensible au courant volumique traversant les canaux lors de chaque changement de milieu.
- À l’aide d’une pipette P200, prélevez les DPBS des deux puits situés de l’autre côté des microsillons en face des NPC fraîchement ensemencés. Ajoutez 200 μL/puits de média motoneuronal du jour 10 et attendez quelques secondes entre le puits supérieur et le puits inférieur pour permettre au milieu de s’écouler dans le canal. Ensuite, ajoutez 6 mL de DPBS par boîte de 10 cm autour de l’appareil pour éviter l’évaporation du milieu pendant l’incubation.
note: Ajoutez des DPBS supplémentaires autour de l’appareil pendant la période de culture si nécessaire.
- Effectuez un changement complet du milieu du motoneurone dans les deux compartiments de l’appareil le jour 11 (vendredi), le jour 14 (lundi) et le jour 16 (mercredi) (tableau 2 et tableau 3). Ajoutez des suppléments de milieux frais le jour du changement de milieu.
note: À partir de ce moment, effectuez tous les changements de support avec une pipette P200. Placez toujours la pointe de la pipette à l’écart du canal au bord du puits et ne retirez pas le liquide directement du canal. Attention à ne pas détacher les dispositifs en silicone. Le retrait et l’ajout du milieu doivent se faire lentement pour éviter le détachement des cellules.
- Retirez soigneusement tous les fluides dans les deux puits à l’aide de CNP en positionnant la pointe de la pipette P200 sur le bord inférieur de la paroi du puits, à l’opposé de l’ouverture du canal. Ajoutez lentement 50 à 100 μL de milieu de motoneurone frais dans le puits supérieur en positionnant la pointe de la pipette P200 sur le bord supérieur de la paroi du puits, à l’opposé de l’ouverture du canal.
- Faites une pause de quelques secondes pour permettre au milieu de s’écouler dans le canal avant d’ajouter 50 à 100 μL de milieu de motoneurone dans le puits inférieur. Répétez ce processus avec précaution jusqu’à ce que les deux puits contiennent 200 μL/puits. Répétez l’opération sur le côté sans cellules.
5. Placage de MAB dans des dispositifs microfluidiques - Jour 17
- Environ 7 jours avant l’ensemencement des anticorps monoclonaux dans les dispositifs microfluidiques (jour 10 de la différenciation des motoneurones), décongelez les anticorps monoclonaux et ensemencez-les dans le milieu de croissance (tableau 1) dans une fiole T75 recouverte de collagène pour permettre une expansion cellulaire suffisante. Voir rubrique 2.
- Au 17e jour de la différenciation des motoneurones (jeudi), dissociez les anticorps monoclonaux comme expliqué à l’étape 2.4, remettez en suspension la pastille cellulaire dans ~500 μL de milieu de croissance et comptez les cellules vivantes en utilisant la méthode de comptage de votre choix.
note: Comme indiqué ci-dessous, assurez-vous de remettre les MAB en suspension dans la bonne quantité de substrat pour permettre un volume de semis optimal.
- Retirez le milieu motoneuronal du côté non ensemencé des microsillons de l’appareil à l’aide d’une pipette P200, lavez doucement avec du DPBS et ensemencez 200 000 MAB par appareil dans 60 à 100 μL de milieu de croissance.
- Dans le puits supérieur droit, ensemencez 30 à 50 μL de suspension cellulaire (100 000 cellules) près de l’ouverture du canal à un angle de 45° et faites glisser doucement le fluide restant le long du fond du puits vers le centre du puits avec la pointe de la pipette. Faites une pause de quelques secondes pour permettre l’écoulement des cellules dans le canal avant de répéter dans le puits inférieur (100 000 cellules dans 30-50 μL).
- Incuber l’appareil à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 5 min pour permettre la fixation des cellules avant de remplir les deux puits fraîchement ensemencés de MAB avec un milieu de croissance supplémentaire (total 200 μL/puits). Incuber à nouveau à 37 °C, 5 % CO2.
REMARQUE : Aucun changement de support n’est nécessaire le jour 17 du côté motoneurone de l’appareil. Le changement de milieu du jour 17 selon la méthode de différenciation des motoneurones précédemment publiée est effectué le jour 18 (vendredi).
6. Mise en œuvre d’un gradient volumétrique et chimiotactique pour favoriser la croissance des neurites des motoneurones vers le compartiment MAB
- Le 18e jour, effectuez un changement complet de milieu du côté du motoneurone avec le milieu du motoneurone du 18e jour (200 μL/puits). Suivez les instructions pour les modifications de support mentionnées aux étapes 4.5.1-4.5.2. Amorcez la différenciation des anticorps monoclonaux dans le compartiment des anticorps monoclonaux de l’appareil (Tableau 2 et Tableau 4).
- Lavez soigneusement les compartiments MAB une fois avec du DPBS avant d’ajouter un milieu de différenciation MAB préchauffé (tableau 4) complété par 0,01 μg/mL d’agrin humain (200 μL/puits).
note: Les MAB fusionnent et forment des myotubes multinucléés au cours d’une semaine.
- Au jour 21, selon le protocole de différenciation des motoneurones (lundi), initier le gradient chimiotactique et volumétrique (Tableau 2 et Tableau 3).
- Ajoutez 200 μL/puits de milieu basal de motoneurone avec 30 ng/mL de facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF), de facteur neurotrophique dérivé de la lignée cellulaire gliale (GDNF) et de facteur neurotrophique ciliaire (CNTF), d’agrin humain (0,01 μg/mL) et de laminine (20 μg/mL) au compartiment du myotube (précédemment défini comme le compartiment MAB). Ajouter le milieu basal du motoneurone (100 μL/puits) sans facteurs de croissance dans le compartiment du motoneurone.
Tableau 1 : Milieu de croissance de l’ABM.Le milieu peut durer 2 semaines à 4 °C. bFGF est ajouté frais le jour de l’utilisation.
| Réactif | Concentration des stocks | Concentration finale |
| IMDM | 1x | 80 % |
| Sérum fœtal bovin | | 15 % |
| Pénicilline/streptomycine | 5000 U/mL | 0,5 % |
| L-glutamine | 50x | 1 % |
| Pyruvate de sodium | 100 millions d’euros | 1 % |
| Acides aminés non essentiels | 100x | 1 % |
| Insuline transferrine sélénium | 100x | 1 % |
| bFGF (ajouté frais) | 50 μg/mL | 5 ng/mL |
Tableau 2 : Milieu basal du motoneurone.Le milieu peut durer 4 semaines à 4 °C.
| Réactif | Concentration des stocks | Concentration finale |
| DMEM/F12 | | 50 % |
| Milieu neurobasal | | 50 % |
| Pénicilline/streptomycine | 5000 U/mL | 1 % |
| L-glutamine | 50x | 0,5 % |
| Supplément N-2 | 100x | 1 % |
| B-27 sans vitamine A | 50x | 2 % |
| β-mercaptoéthanol | 50 millions d’euros | 0,1 % |
| acide ascorbique | 200 μM | 0,5 μM |
Tableau 3 : Suppléments de milieu de motoneurones.Les suppléments sont ajoutés frais le jour de l’utilisation dans le milieu basal du motoneurone.
| jour | Réactif | Concentration des stocks | Concentration finale | compartiment |
| Jour 10/11 | Agoniste lissé | 10 millions d’euros | 500 nM | les deux |
| Acide rétinoïque | 1 million d’euros | 0,1 μM | |
| DAPT | 100 millions d’euros | 10 μM |
| Le BDNF | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL |
| GDNF | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL |
| Jour 14 | DAPT | 100 millions d’euros | 20 μM | les deux |
| Le BDNF | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL | |
| GDNF | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL |
| Jour 16 | DAPT | 100 millions d’euros | 20 μM | les deux |
| Le BDNF | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL | |
| GDNF | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL |
| Le CNTF | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL |
| Jour 18 | Le BDNF | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL | Motoneurone |
| GDNF | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL | |
| Le CNTF | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL |
| Jour 21+ | Le BDNF | 0,1 mg/mL | 30 ng/mL | Myotube |
| GDNF | 0,1 mg/mL | 30 ng/mL | |
| Le CNTF | 0,1 mg/mL | 30 ng/mL |
| Agrin | 50 μg/mL | 0,01 μg/mL |
| Laminine | 1 mg/mL | 20 μg/mL |
| Jour 21+ | Aucun supplément | | | Motoneurone |
Tableau 4 : Milieu de différenciation MAB.Le milieu peut durer 2 semaines à 4 °C. Agrin est ajouté frais le jour de l’utilisation.
| jour | Réactif | Concentration des stocks | Concentration finale | compartiment |
| Jour 18 | DMEM/F12 | | 97 % | MAB |
| Pyruvate de sodium | 100 millions d’euros | 1 % |
| Sérum de cheval | | 2 % |
| Agrin | 50 μg/mL | 0,01 μg/mL |
