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Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Dissection d’embryons et dissociation de tissus
- Hébergez des rats femelles adultes (200-250 g) à une température constante (22 ± 1 °C) et à une humidité relative (50 %) selon un horaire régulier clair-obscur (lumière de 7 h à 19 h) dans l’animalerie. Assurez-vous que la nourriture et l’eau sont librement disponibles.
- Anesthésier une rat femelle enceinte après 18 jours de développement (E18) à l’aide d’isoflurane à 3 %. Ensuite, sacrifiez l’animal par luxation cervicale.
- Retirez l'hippocampe de chaque embryon de rat et placez-le dans la solution saline équilibrée de Hank glacée sans Ca2+ et Mg2+. Au 18e jour de développement, les tissus de l’hippocampe et du cortex sont très mous et n’ont pas besoin d’être coupés en petits morceaux. Vous trouverez de plus amples détails.
- Dissocier le tissu dans 0,125 % de la solution de trypsine/Hank contenant 0,05 % d'ADNASE pendant 18 à 20 min à 37 °C.
- Prélever la solution surnageante à l’aide d’une pipette Pasteur et arrêter la digestion enzymatique en ajoutant un milieu contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) pendant 5 min.
- Retirez le milieu avec du FBS et lavez-le une fois avec le milieu avec son supplément, 1 % L-glutamine, gentamicine 10 μg/ml. Retirez à nouveau le milieu avec une pipette Pasteur et remplissez-le à nouveau avec une petite quantité (500 μl) de milieu de croissance avec son supplément, 1 % L-glutamine, gentamicine 10 μg / ml.
- Dissocier mécaniquement la pastille tissulaire à l’aide d’une pipette Pasteur étroite jusqu’à ce qu’une suspension laiteuse de cellules apparaisse. Il n’est pas nécessaire de centrifuger la suspension cellulaire.
- Diluer le petit volume de suspension cellulaire avec le milieu de croissance pour obtenir un volume final de 2,0 ml. Compter la concentration cellulaire obtenue à l’aide d’une chambre d’hémocytomètre. Diluez cette concentration à 1:5 afin d’obtenir la concentration cellulaire souhaitée de 600-700 cellules/μl.
2. Placage cellulaire
- Cellules plaques à une densité d’environ 2 000 cellules/mm2 sur la zone active de la MEA, définie par la contrainte PDMS pour créer un réseau neuronal 2D.
note: Chaque hippocampe contient environ 5 x 105 cellules (1 x 106 pour un seul embryon). Disséquez 6 embryons pour obtenir une quantité totale de 6 x 106 cellules dans 2 ml, et une concentration estimée de 3 000 cellules/μl. Diluez cette concentration à 1:5 afin d’obtenir la concentration cellulaire souhaitée et plaquez environ 600-700 cellules/μl. Si la zone MEA délimitée par la contrainte PDMS est d’environ 7,065mm2 et que le nombre total de cellules plaquées est de 600 cellules/μl x 24 μl = 14 400 cellules, la densité finale de 2 038 cellules/mm2.
- Placez les appareils MEA dans l’incubateur avec une atmosphère de CO2 humidifiée (5 %) à 37 °C.
- Répartir 160 μl de suspension avec une concentration cellulaire de 600 à 700 cellules/μl (environ 100 000 cellules) sur la surface de la monocouche de microbilles positionnée à l’intérieur des plaques multipuits pour compléter l’étape préliminaire de construction de la culture tridimensionnelle. Placez les plaques multipuits dans l’incubateur avec une atmosphère de CO2 humidifiée (5 %) à 37 °C.
>3. 3D Construction du réseau neuronal
- 6 à 8 heures après le placage, transférez très soigneusement la suspension (microbilles avec neurones) des plaques multipuits à l’intérieur de la zone délimitée par la contrainte PDMS à l’aide d’un jeu de pipettes pour un volume d’environ 30 à 40 μl. Après chaque transfert, attendez environ une demi-minute, pour permettre aux microbilles de s’auto-assembler dans une structure compacte hexagonale.
- Une fois toutes les couches déposées et assemblées spontanément, remplissez avec une grosse goutte d’environ 300 μl de milieu le haut de la zone délimitée par la contrainte PDMS.
- Mettre la structure 3D couplée au MEA dans l’incubateur (T = 37,0 °C, CO2 = 5 %) pendant 48 h avant d’ajouter un volume final (environ 1 ml) de milieu de culture avec son supplément.
note: Considérons le nombre total de billes sur les plaques multipuits avec insert de membrane (30 000) et le nombre de billes sur une seule couche sur le dispositif MEA (6 000). La structure 3D résultante est composée de 5 couches de microbilles et de cellules. Étant donné que le réseau neuronal 3D n’est pas géométriquement parfait, la structure 3D résultante pourrait comprendre 5 à 8 couches.
- Le lendemain du placage, ajoutez soigneusement le volume final du fluide (environ 900 μl) à l’intérieur de l’anneau MEA. Maintenez les cultures 3D dans une atmosphère de CO2 humidifiée (5 %) à 37 °C pendant 4 à 5 semaines. Remplacez la moitié du milieu une fois par semaine.