Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation et culture des astrocytes corticaux
REMARQUE : Terminez ces étapes du protocole au moins 7 jours avant de passer aux étapes suivantes, car les cultures d’astrocytes doivent se développer en monocouches confluentes avant que les neurones ne soient préparés. Les astrocytes primaires sont dérivés de cultures gliales mixtes obtenues à partir de petits souris vers le jour postnatal (P) 0-3. Trois cerveaux (6 cortex) par fiole T75 doivent être utilisés.
- Préparez le milieu astrocytaire en complétant le milieu Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco avec 10 % v/v de sérum de cheval et 0,1 % v/v de gentamicine dans des conditions stériles. Conservez le milieu à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
- Enduire 3 fioles T75 de poly-D-Lysine (PDL ; dans de l’eau de culture cellulaire) pendant au moins 1 h à 37 °C en présence de 6 % v/v de CO2. Après l’enrobage, laver les flacons deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer les cations non liés, et ajouter 9 ml de milieu astrocytaire.
- Pour la préparation des cervelles, ajoutez 10 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) dans 1 boîte de Pétri de 10 cm et 1 ml de HBSS dans 1 tube de 15 ml (quel que soit le nombre de cerveaux qui seront utilisés). Gardez une paire de ciseaux chirurgicaux, 2 pinces fines et des jumelles à portée de main pour l’intervention.
- Décapitez rapidement 3 chiots avec les ciseaux chirurgicaux et récupérez les têtes dans un plat vide de 10 cm.
- Effectuez la préparation des cortex sous les jumelles. À l’aide de deux pinces fines, retirez la peau dorsale du crâne sur la ligne médiane, en partant du cou vers le niveau des yeux. Par la suite, le cerveau avec ses vaisseaux sanguins est visible sous le crâne.
- Fixez la tête à l’extrémité rostrale à l’aide d’une paire de pinces et incisez la ligne médiane du crâne, en commençant par l’extrémité postérieure. Par la suite, coupez les moitiés droite et gauche du crâne pour exposer le cerveau.
- Fermez l’extrémité de la pince et positionnez-la ventralement sous le cerveau. Retirez le cerveau du crâne et transférez-le dans la boîte de Pétri de 10 cm remplie de HBSS. Procédez de la même manière avec le spécimen restant jusqu’à ce que tous les cerveaux soient rassemblés dans la boîte.
- Après avoir collecté les cerveaux, commencez par la séparation des cortex en pinçant le cerveau postérieur à l’aide d’une paire de pinces comme une paire de ciseaux. Effectuez une incision médiane entre les deux hémisphères à l’aide d’une paire de pinces. Fixez soigneusement le cerveau à l’aide d’une pince et coupez le mésencéphale et les bulbes olfactifs à l’aide d’une deuxième pince pour obtenir les moitiés corticales.
- Fixez une moitié corticale à l’aide d’une pince et décollez les méninges des hémisphères en les détachant du bord latéral, puis en les tirant de la surface corticale à l’aide d’une deuxième pince.
- Retournez la moitié corticale avec sa surface orientée vers le bas vers le plat ; disséquez soigneusement et retirez l’hippocampe en forme de croissant à l’aide d’une paire de pinces. Transférez les cortex simples dans le tube conique de 15 ml à l’aide d’une pince fermée pour porter un cortex individuel.
- Après avoir recueilli tous les cortex, passez au capot à flux laminaire stérile et commencez les préparations pour la dissociation du tissu cortical.
- Ajouter 1 mL de DMEM dans un tube de réaction de 2 mL et ajouter 0,1 % p/v de papaïne (30 unités). Incuber la suspension dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce qu’une solution clarifiée se développe (environ 3 min). Ajouter 0,24 mg/mL de L-cystéine et 20 μg/mL d’ADNASE et agiter doucement.
REMARQUE : Pour la digestion, environ 1 mL de solution enzymatique est nécessaire.
- Filtrer (pores de 0,22 m) pour obtenir 1 mL de solution stérile avant de l’ajouter au tissu cortical. Incuber les tubes pendant 30 min à 1 h à 37 °C (c’est-à-dire dans un bain-marie).
REMARQUE : Les étapes 1.11 à 1.14 sont essentielles et doivent être terminées dans les 15 minutes.
- Pour mettre fin à la réaction de digestion, ajoutez 1 mL de milieu astrocytaire et triturez soigneusement le tissu digéré à l’aide d’une pipette de 1 mL. Pour la trituration, déplacez doucement le piston de la pipette, aspirant et extrudant ainsi la suspension de tissu cortical.
- Une fois que le tissu a été dissocié en une suspension unicellulaire, ajoutez 5 mL de milieu astrocytaire et centrifugez pendant 5 min à 216 x g.
- Aspirez soigneusement le surnageant de la pastille résultante et remettez les cellules en suspension dans un milieu astrocytaire de 1 ml.
- Ajouter les suspensions cellulaires dans des fioles T75 remplies de milieu astrocytaire de 9 mL (voir 1.2).
- Incuber les cellules à 37 °C dans l’incubateur en présence de 6 % v/v de CO2. Après 4 jours, effectuez le premier changement complet de milieu (10 mL). Par la suite, changez de milieu de culture tous les 2 à 3 jours.
- Après 7 jours, vérifiez si les cellules ont formé une monocouche confluente. Sinon, attendez encore 2 à 3 jours jusqu’à ce que la confluence complète de la culture soit atteinte.
REMARQUE : Les astrocytes présentent de grands corps cellulaires aplatis, se localisent au fond du ballon et ne développent pas de processus cellulaires notables. Ils diffèrent des petites cellules progénitrices brillantes à contraste de phase et des microglies résidant au-dessus de la monocouche.
- Afin de se débarrasser des cellules progénitrices et d’obtenir une culture d’astrocytes purs, placez les flacons T75 sur un agitateur orbitaire et agitez les cultures O/N à 250 tr/min. Assurez-vous que la température est réglée à 37 °C et que le filtre du ballon est scellé avec un film de laboratoire pour éviter l’évaporation du CO2.
- Le lendemain, aspirer le milieu et ajouter 10 ml de milieu de culture frais rempli de 20 μM de cytosine-1-β-D-arabinofuranoside (AraC) pour éliminer les cellules résiduelles en division.
REMARQUE : l’incubation avec AraC pendant 2 à 3 jours dans l’incubateur à 37 °C, 6 % de CO2 donnera lieu à une culture d’astrocytes purs.
- Surveiller la pureté des cultures d’astrocytes par inspection visuelle au microscope optique. Si des cellules progénitrices brillantes résiduelles à contraste de phase et une microglie résident toujours au-dessus de la monocouche astrocytaire (voir étape 1.16), répétez les étapes 1.18 et 1.19.
REMARQUE : Les monocouches d’astrocytes confluentes et pures peuvent être maintenues jusqu’à 14 jours dans l’incubateur (37 °C, 6 % v/v CO2) avant de passer à l’étape suivante. Changez la moitié du milieu tous les 3 jours. Ne collectez pas, ne congelez pas et ne dégelez pas les astrocytes, car ces cellules perdront leurs propriétés de soutien neuronal au cours de la procédure de stockage.
2. Préparation des astrocytes pour la coculture indirecte
REMARQUE : 48 - 72 h avant de préparer les neurones, transférez les astrocytes dans les inserts de culture cellulaire. Généralement, un seul ballon T75 délivre un nombre suffisant de cellules pour soutenir les cultures neuronales obtenues avec une seule préparation.
- Placez autant d’inserts que nécessaire dans des plaques à 24 puits. Enduire chaque insert d’une quantité de 10 μg/mL de PDL (dissoute dans de l’eau de culture cellulaire) pendant environ 1 h à 37 °C, 6 % v/v de CO2. Après l’incubation, lavez les inserts deux fois avec du PBS. En attendant, procédez à la préparation des astrocytes.
REMARQUE : Les inserts remplis de PBS peuvent être conservés jusqu’à ce que la suspension de cellules astrocytaires soit prête à l’emploi.
- Aspirez le milieu astrocytaire (avec AraC) et lavez la culture une fois avec 10 ml de PBS pour vous assurer que tout sérum résiduel est éliminé.
- Ajouter 3 mL de trypsine-EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) à 0,05 % dans les flacons et incuber les cellules pour la trypsinisation à 37 °C, 6 % v/vCO2 pendant environ 10 min.
- Contrôlez le détachement des cellules par inspection visuelle à l’aide d’un microscope et facilitez le détachement des cellules en tapotant le côté des flacons contre le bureau.
REMARQUE : Les étapes 2.5 à 2.8 sont critiques et doivent être terminées dans les 15 à 20 minutes.
- Après la trypsinisation, remettre doucement les cellules en suspension dans un milieu astrocytaire de 7 mL et transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL. Centrifugeuse pendant 5 min à 216 x g.
- Aspirez soigneusement le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu astrocytaire.
- Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage.
- Remplissez le fond des puits de la plaque à 24 puits avec un milieu astrocytaire de 500 μL et transférez 25 000 cellules dans un milieu astrocytaire de 500 μL dans chaque insert individuel. Incuber la culture à 37 °C, 6 % v/v CO2.
REMARQUE : Après 42 à 72 h, les cultures atteindront environ 100 % de confluence. À ce stade, la pureté de la culture peut être vérifiée par immunocytochimie. Les cultures confluentes peuvent être maintenues jusqu’à 7 jours jusqu’à ce qu’elles passent à l’étape suivante. Changez la moitié du milieu tous les 3 jours.
3. Préparation des neurones primaires de l’hippocampe
REMARQUE : Les neurones primaires de l’hippocampe de souris doivent provenir d’embryons E15.5 - E16 de souris enceintes chronométrées.
- Préparez le milieu neuronal (MEM avec 10 mM de pyruvate de sodium, 0,1 % p/v d’ovalbumine, 2 % v/v de supplément de milieu B27 et 0,1 % v/v de gentamicine (filtrée stérile)), et le milieu de préparation (HBSS avec 0,6 % p/v de glucose et 10 mM d’HEPES (acide éthanesulfonique 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine)). Préchauffer et prééquilibrer le milieu neuronal dans des flacons filtrants à 37 °C, 6 % v/v CO2.
- Placez les lamelles en verre (12 mm de diamètre) dans les puits des plaques à 24 puits (utilisez les lamelles spéciales, qui sont crantées pour l’utilisation avec des inserts de culture cellulaire).
- Enduire pendant au moins 1 h de Poly-DL-Ornithine dans de l’eau (de qualité culture cellulaire) à 37 °C. Utiliser au moins 500 μL par puits pour s’assurer que les lamelles sont complètement recouvertes. Lavez les puits deux fois avec du PBS. Laissez le PBS dans les puits jusqu’à ce que les cellules soient plaquées. Assurez-vous que les puits ne se dessèchent pas.
- Pour disséquer l’hippocampe, préparez 3 plats de 10 cm remplis de milieu de préparation et 1 tube de 2 ml avec 1 ml de milieu de préparation. Préparez des ciseaux et 2 pinces fines.
- Sacrifiez la souris enceinte par luxation cervicale, stérilisez l’abdomen en le lavant avec de l’éthanol à 70 % v/v et ouvrez l’abdomen à l’aide de ciseaux tranchants. Excise soigneusement l’utérus perlé avec des ciseaux et transfère l’organe dans un plat de 1x 10 cm rempli de milieu de préparation.
- Ensuite, retirez les embryons de l’utérus. Incisez soigneusement l’utérus et retirez l’amnios sans endommager les embryons à l’aide de 2 pinces. Par la suite, décapitez chaque embryon à l’aide d’une paire de ciseaux et transférez les têtes dans un second plat de 10 cm fourni avec du milieu de préparation.
- Procédez à la préparation des têtes (similaire à la préparation décrite aux points 1.4 à 1.7).
- Immobiliser la tête à l’aide d’une paire de pinces et inciser le crâne et la peau dans la région du cou près du cerveau postérieur, perpendiculairement au neuraxis. Utilisez une deuxième paire de pinces pour soulever à la fois le crâne et la peau qui le recouvre, et pliez la calotte crânienne molle vers l’extrémité rostrale de la tête, exposant ainsi le cerveau.
- À l’aide de 2 pinces, détachez le cerveau de la cavité crânienne. Pour ce faire, fermez 1 paire de pinces et séparez le cerveau du crâne en commençant par les bulbes olfactifs et en allant vers le cerveau postérieur. Récupérez les cerveaux dans un autre plat de 10 cm rempli de milieu de préparation.
- Disséquez l’hippocampe des fractions cortex comme décrit ci-dessus pour la préparation des astrocytes (étape 1.6). Retirez l’hippocampe de chaque hémisphère et recueillez-le dans le tube de 2 mL rempli de milieu de préparation.
- Une fois la dissection terminée, transférez le tube sur le banc stérile à flux laminaire et digérez le tissu de l’hippocampe avec 1 ml de solution de digestion contenant de la papaïne. Préparez la solution de digestion comme décrit à l’étape 1.9 - 1.10, mais utilisez MEM à la place DMEM.
REMARQUE : Les étapes 3.9 à 3.12 sont essentielles et doivent être terminées dans un délai de 10 à 15 minutes.
- Une fois la digestion terminée, prélevez soigneusement la solution de digestion par aspiration douce à l’aide d’une pipette.
- Lavez l’hippocampe 3 fois avec un milieu neuronal en ajoutant séquentiellement puis en aspirant soigneusement 1 ml de milieu de culture frais par cycle de lavage. Ne centrifugez pas la suspension cellulaire.
- Après la dernière étape de lavage, triturez soigneusement le tissu dans un milieu neuronal de 1 ml.
- Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage et d’une plaque de 35 000 cellules dans un milieu neuronal de 500 μL par puits unique d’une plaque à 24 puits (la plaque mentionnée en 3.2).
REMARQUE : En option, une aliquote cellulaire peut être contre-colorée avec du bleu de trypan pour évaluer la vitalité de la préparation cellulaire. Contrôlez la densité de placage par inspection visuelle à l’aide du microscope (généralement 90 à 110 cellules par champ visuel d’un objectif standard 10X).
- Placez les neurones dans l’incubateur à 37 °C, 6 % v/v CO2 pendant 1 h.
- Après l’incubation, sortez de l’incubateur les inserts préparés (ensemencés avec des monocouches d’astrocytes confluents) (voir étape 2.8). Remplacez le milieu par aspiration du milieu astrocytaire et son remplacement par un milieu de neurones frais de 500 μl.
REMARQUE : Les inserts doivent abriter des monocouches d’astrocytes confluentes après 2 à 3 DIV (Days In Vitro).
- Placez soigneusement les inserts avec les astrocytes dans les puits qui contiennent les cultures de neurones (étape 3.13) à l’aide d’une pince stérile.
- Remettez la co-culture indirecte neurone-astrocytes résultante dans l’incubateur à 37 °C, 6 % v/v CO2,
REMARQUE : Dans ces conditions, les neurones peuvent être cultivés jusqu’à 4 semaines dans un milieu complètement défini. Aucun changement de support n’est nécessaire. Pour les cultures de longue durée, il est recommandé de remplir les puits vides avec de l’eau stérile afin de réduire l’évaporation de la plaque à 24 puits.
