Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Dissection du cerveau du rat ou de la souris
REMARQUE : Les souris et les rats peuvent être utilisés. Des animaux de plus de 18 ans peuvent également être utilisés (nous avons testé jusqu’à P12), mais l’élimination des méninges deviendra de plus en plus difficile. De plus, le rendement cellulaire et la santé diminueront, car les cellules cérébrales des animaux plus âgés auront formé des processus et des connexions complexes qui peuvent se rompre lors de la dissociation des tissus, entraînant une augmentation de la mort cellulaire. Les préparations corticales sont décrites ici, mais d’autres régions du cerveau peuvent également être utilisées.
- Placez 0,05 % de trypsine-EDTA dans un bain-marie à 37 °C.
- Euthanasier les animaux (rates gestantes pour les petits E19, ou animaux P0-P8) en augmentant lentement la concentration de CO2 et en isolant les cerveaux. Les étapes suivantes nécessitent une technique stérile.
- Si vous travaillez avec du tissu embryonnaire, retirez d’abord les embryons de l’utérus et ouvrez les sacs embryonnaires, puis coupez immédiatement les têtes avec des ciseaux. Lorsque toutes les têtes sont coupées, transférez-les dans un milieu de dissection pré-refroidi.
- Une fois les têtes immergées dans le milieu, ouvrez la peau et le crâne (les deux sont très mous chez les jeunes animaux) avec des pinces et pincez le cervelet. Faites levier avec précaution sur le reste du cerveau vers le haut et hors du crâne.
note: Deux à quatre embryons E19 produisent suffisamment de tissu pour au moins huit boîtes de 10 cm d’astrocytes corticaux plaquées à 500 000 cellules par boîte le jour de la dissection.
- Pour les nouveau-nés ou les chiots plus âgés, coupez la tête avec des ciseaux et isolez le cerveau en coupant médialement la peau en ligne droite de l’arrière de la tête au bout du nez. Écartez la peau et coupez soigneusement le crâne à gauche et à droite, puis soulevez l’os du crâne. Coupez le cervelet et faites levier pour faire levier sur le reste du cerveau vers le haut et hors du crâne.
note: Deux à trois petits P0-P8 produisent suffisamment de tissu pour au moins huit boîtes de 10 cm d’astrocytes corticaux plaquées à 500 000 cellules par boîte le jour de la dissection.
- Séparez le cortex de la structure sous-jacente du mésencéphale. Placez la pince dans la fissure longitudinale entre les hémisphères, puis déplacez la pince entre le cortex et les structures du mésencéphale d’un hémisphère (perpendiculaire à la fissure longitudinale) pour libérer chaque hémisphère.
- À l’aide de la pince, retirez toutes les méninges de chaque hémisphère (et de son hippocampe), puis séparez l’hippocampe. Si des astrocytes de l’hippocampe sont nécessaires, placez chaque hippocampe dans un tube de 15 ml rempli de milieu de dissection de 14 ml sur de la glace.
- Retirez d'autres zones du cortex de chaque hémisphère si des régions spécifiques sont nécessaires (par exemple, le cortex frontal). Coupez tout tissu cortical à utiliser pour générer des astrocytes en morceaux ne dépassant pas 1 mm3. Prélever tous les morceaux de tissu cortical dans un tube séparé de 15 ml rempli d’un milieu de dissection sur de la glace.
2. Digestion et dissociation des tissus
- Une fois que tous les morceaux de tissu sont recueillis, attendez qu’ils se déposent au fond du tube, puis aspirez autant de milieu que possible.
- Ajouter 2 à 3 mL de trypsine-EDTA à 0,05 % à l’aide d’une pipette sérologique et incuber les tubes dans un bain-marie à 37 °C pendant 20 min
note: Libérez rapidement toute la trypsine-EDTA de la pipette pour mélanger les morceaux de tissu et leur permettre de se déposer à nouveau.
- Aspirez soigneusement la trypsine-EDTA, en laissant les morceaux de tissu dans le moins de liquide possible, au fond du tube.
- Ajouter 5 ml de milieu de dissection prérefroidi pour éliminer la trypsine-EDTA restante. Pipette sur le côté de la partie supérieure du tube pour réaliser le mélange des morceaux de tissu.
- Aspirez le milieu de dissection et laissez les morceaux de tissu dans le moins de liquide possible. Répétez cette étape de lavage avec un milieu de dissection pré-refroidi deux fois de plus.
- Après la dernière étape de lavage, ajoutez 1 ml de DMEM+ (réchauffé à température ambiante) à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 μL, et triturez le tissu en pipetant de haut en bas sans introduire de bulles.
note: Il est important d’éviter de produire des bulles, car cela peut modifier le pH de la solution, à laquelle les astrocytes sont très sensibles.
- Placez une crépine de 100 μm dans l’ouverture d’un tube de 50 ml et pré-mouillez le filtre avec 4,5 ml de DMEM+ pré-refroidi.
- Pipetez 1 mL de suspension de tissu dissocié dans la crépine cellulaire et ajoutez 4,5 mL de DMEM+ pré-refroidi pour laver les cellules à travers la crépine cellulaire.
3. Cellules de passage
- La veille du passage, enduire les plaques de culture cellulaire de 0,04 % de PEI.
- Le jour in vitro (DIV) 7 après la dissection, placez les boîtes de 10 cm avec les cellules en DMEM+ sur un agitateur de laboratoire dans l’incubateur et secouez les boîtes à 110 tr/min pendant 6 h.
- Lavez deux fois l’IPE des lamelles enrobées avec de l’eau distillée désionisée. Ajouter du fluide NB+H aux plaques (500 μL par puits pour les plaques à 24 puits et 2 mL par puits pour les plaques à 6 puits). Prééquilibrez les plaques dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant que les plats de 10 cm sont agités, ou pendant au moins 30 min.
- 20 à 30 min avant la fin de l’agitation de 6 h, préchauffer 1x PBS, DMEM+, NB+H et 0,25 % trypsine-EDTA à 37 °C dans le bain-marie.
- Après 6 h d’agitation, retirez les plats de culture de l’agitateur et remplacez immédiatement le milieu (qui contient des neurones, des oligodendrocytes et des microglies secoués) par 10 ml préchauffé 1x PBS par plat.
note: Il est important d’aspirer immédiatement l’ancien milieu contenant les cellules détachées pour éviter que les cellules non astrocytaires ne se rattachent.
- Retirer le PBS et ajouter 3 ml de trypsine-EDTA préchauffé par plat. Incuber chaque plat pendant 4 min dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2
- Ajoutez 5 ml de DMEM+ préchauffé à la trypsine-EDTA de 3 ml dans chaque boîte, pipetez les cellules de la boîte à l’aide d’une pipette sérologique de 5 ml et prélevez la suspension cellulaire dans un tube de 50 ml.
note: Pipette directement à partir du fond de la boîte - le fond de la boîte doit devenir plus clair à mesure que les cellules se détachent. N’utilisez que du milieu contenant du sérum (à la place du DMEM+), car le sérum inactive la trypsine.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 3 220 x g à 20 °C pendant 4 min.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de NB+H préchauffé
.
4. Placage cellulaire pour les cultures finales d’astrocytes
- Comptez les cellules.
- Plaque de 20 000 cellules par puits dans des plaques de 6 puits (dans un milieu NB+H de 2 ml par puits) ou de 5 000 cellules par puits dans des plaques de 24 puits (dans un milieu NB+H de 500 μL par puits).
- Maintenir les cultures cellulaires dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 jusqu’à un traitement ou une analyse complémentaire.
