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Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Différenciation des hiPSC positives rtTA/Ngn2 en neurones sur les MEA à 6 puits et les lamelles en verre
REMARQUE : Dans ce protocole, les détails sont fournis pour différencier les hiPSC positifs rtTA/Ngn2 sur deux substrats différents, c’est-à-dire les MEA à 6 puits (dispositifs composés de 6 puits indépendants avec 9 microélectrodes intégrées d’enregistrement et 1 microélectrode de référence par puits) et des lamelles en verre dans les puits d’une plaque à 24 puits. Les protocoles peuvent toutefois être facilement adaptés à des substrats plus grands (par exemple, pour les puits de plaques de 12 ou 6 puits), en augmentant les valeurs mentionnées en fonction de la surface.
- Préparation des MEA ou lamelles en verre (jour 0 et jour 1)
- La veille du début de la différenciation, stérilisez les AEM selon les recommandations du fabricant.
- Diluer la protéine d’adhésion Poly-L-Ornithine (PLO) dans de l’eau ultrapure stérile jusqu’à une concentration finale de 50 μg/mL. Enduisez la surface de l’électrode active des MEA à 6 puits en plaçant une goutte de 100 μL de PLO dilué dans chaque puits. Placez les lamelles dans les puits de la plaque à 24 puits à l’aide d’une pince à épiler stérile. Ajouter 800 μL de PLO dilué dans chaque puits. Empêchez les lamelles de flotter en les poussant vers le bas avec la pointe de pipette de 1000 μL.
- Incuber les AEM à 6 puits et les plaques O/N à 24 puits dans un incubateur humidifié à 37 °C avec une atmosphère de 5 % de CO2. Le lendemain, aspirez le PLO dilué. Lavez deux fois les surfaces vitrées des MEA à 6 puits et des lamelles avec de l’eau stérile ultrapure.
- Diluer la laminine dans du DMEM/F12 froid jusqu’à une concentration finale de 20 μg/mL (pour les MEA à 6 puits) et de 10 μg/mL (pour les lamelles en verre). Enduisez immédiatement la surface de l’électrode active des MEA à 6 puits en plaçant une goutte de 100 μL dans chaque puits. De même, ajoutez 400 μL de laminine diluée dans chaque puits de la plaque à 24 puits pour enrober les lamelles. Empêchez les lamelles de flotter en les poussant vers le bas avec la pointe de pipette de 1 000 μL.
- Incuber les AEM à 6 puits et la plaque à 24 puits dans un incubateur humidifié à 37 °C avec une atmosphère de 5 % de CO2 pendant au moins 2 h.
- Plaque des hiPSCs (jour 1)
REMARQUE : Les volumes mentionnés aux étapes 3.2.1 à 3.2.4 supposent que les hiPSC rtTA/Ngn2-positifs sont cultivés dans une plaque à 6 puits et que les cellules d’un puits sont récoltées. Les volumes nécessaires pour plaquer les cellules sur les AME à 6 puits et/ou les lamelles dépendent du nombre d’AME à 6 puits et/ou du nombre de lamelles utilisées dans l’expérience ; Les numéros spécifiés aux étapes 3.2.6 à 3.2.8 permettent une mise à l’échelle vers différentes tailles d’expérience.
- Milieu chaud de DMEM/F12, de CDS et d’E8 avec 1 % (v/v) de pénicilline/streptomycine à R/T. Ajouter de la doxycycline à une concentration finale de 4 μg/mL et un inhibiteur de ROCK au milieu E8.
- Aspirez le milieu usé des hiPSC rtTA/Ngn2-positifs et ajoutez 1 mL de CDS aux hiPSC. Incuber 3 à 5 min dans un incubateur humidifié à 37 °C avec une atmosphère de 5 % de CO2. Vérifiez au microscope si les cellules se détachent les unes des autres.
- Ajoutez 2 mL de DMEM/F12 dans le puits, suspendez doucement les cellules à l’aide d’une pipette de 1 000 μL et transférez les cellules dans un tube de 15 mL. Ajouter 7 mL de DMEM/F12 à la suspension cellulaire. Faites tourner les cellules à 200 x g pendant 5 min.
- Aspirez le surnageant et ajoutez 2 mL du milieu E8 préparé. Dissociez les hiPSC en plaçant l’extrémité d’une pipette de 1 000 μL contre le côté du tube de 15 mL et en remettant doucement les cellules en suspension. Vérifiez au microscope si les cellules sont dissociées.
- Déterminer le nombre de cellules (cellules/mL) à l’aide d’une chambre d’hémocytomètre.
note: Un puits à plaque à 6 puits à 80 - 90 % de confluence donnera généralement 3,0 - 4,0 x 106 cellules au total.
- Aspirez la laminine diluée. Pour les AEM à 6 puits, diluer les cellules pour obtenir une suspension cellulaire de 7,5 x 105 cellules/mL. Plaquez les cellules en ajoutant une goutte de 100 μL de la suspension de cellule sur la zone de l’électrode active dans chaque puits des MEA à 6 puits. Pour les lamelles, diluer les cellules pour obtenir une suspension cellulaire de 4,0 x 104 cellules/mL. Plaquez les cellules en ajoutant 500 μL de suspension cellulaire dans les puits de la plaque à 24 puits.
note: La densité cellulaire finale sur les AME est plus élevée que sur les lamelles (figures 1A et B). Nous avons constaté que cette densité cellulaire élevée était nécessaire pour enregistrer correctement l’activité du réseau. Dans le protocole, les nombres optimaux pour les tests sont fournis.
- Placez les AEM à 6 puits et la plaque à 24 puits dans un incubateur humidifié à 37 °C avec une atmosphère de 5 % de CO2 pendant 2 h (AEM) ou O/N (plaque à 24 puits).
- Après 2 h, ajoutez soigneusement 500 μL du milieu E8 préparé dans chaque puits des MEA à 6 puits. Placez les MEA à 6 puits O/N dans un incubateur humidifié à 37 °C avec une atmosphère de 5 % de CO2.
- Changer de support (jour 2)
- Le lendemain, préparez DMEM/F12 avec 1 % (v/v) de supplément N-2, 1 % (v/v) d’acides aminés non essentiels et 1 % (v/v) de pénicilline/streptomycine. Ajouter de la neurotrophine-3 recombinante humaine (NT-3) à une concentration finale de 10 ng/mL, du facteur neurotrophique dérivé du cerveau recombinant humain (BDNF) à une concentration finale de 10 ng/mL et de la doxycycline à une concentration finale de 4 μg/mL. Chauffer à feu moyen à 37 °C.
- Ajouter la laminine à une concentration finale de 0,2 μg/mL dans le milieu. Filtrez le milieu obtenu. Aspirez le fluide usé des puits des MEA à 6 puits et de la plaque à 24 puits et remplacez-le par le milieu préparé. Incuber les AEM à 6 puits et les plaques O/N à 24 puits dans un incubateur humidifié à 37 °C avec une atmosphère de 5 % de CO2.
- Ajouter des astrocytes de rat (jour 3)
REMARQUE : Les volumes mentionnés dans ce protocole supposent que les astrocytes de rat sont cultivés dans des flacons de culture T75. Il est essentiel que les astrocytes de rat ajoutés aux cultures soient de bonne qualité. Nous utilisons deux critères pour vérifier si les astrocytes de rat sont de bonne qualité. Tout d’abord, la culture d’astrocytes de rat devrait être capable de croître confluente dans les dix jours suivant l’isolement du cerveau embryonnaire du rat. Deuxièmement, après avoir divisé la culture d’astrocytes de rat, les astrocytes de rat devraient être capables de former une monocouche confluente et tessellée (Figure 1C). Si la culture d’astrocytes de rat ne remplit pas ces deux critères, nous conseillons de ne pas utiliser cette culture pour des expériences de différenciation.
- Réchauffer le DPBS et le DMEM/F12 avec 1 % (v/v) de pénicilline/streptomycine à 37 °C.
- Aspirer le milieu usé de la culture d’astrocytes de rat. Lavez la culture en ajoutant 5 ml de DPBS et agitez-la doucement.
- Aspirez le DPBS et ajoutez 5 mL de trypsine-EDTA à 0,05 %. Agitez doucement la trypsine-EDTA. Incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C avec une atmosphère de 5 % de CO2 pendant 5 à 10 min.
- Vérifiez au microscope si les cellules sont détachées. Détachez les dernières cellules en frappant la fiole à quelques reprises.
- Ajouter 5 mL de DMEM/F12 dans la fiole. Triturez doucement les cellules à l’intérieur du ballon à l’aide d’une pipette de 10 ml. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml. Faites tourner le tube à 200 x g pendant 8 min.
- Aspirez le surnageant et mettez les cellules en suspension dans 1 mL de DMEM/F12. Déterminer le nombre de cellules (cellules/ml) à l’aide d’une chambre d’hémocytomètre.
- Ajouter 7,5 x 104 astrocytes par puits des AEM à 6 puits. Ajouter 2,0 x 104 astrocytes par puits de la plaque à 24 puits. Incuber les AEM et la plaque O/N à 24 puits dans un incubateur humidifié à 37 °C avec une atmosphère de 5 % de CO2.
- Changer de support (jour 4)
- Préparez un milieu neurobasal avec un supplément de B-27 à 2 % (v/v), 1 % (v/v) de L-alanyl-L-glutamine et 1 % (v/v) de pénicilline/streptomycine. Ajouter du NT-3 à une concentration finale de 10 ng/mL, du BDNF à une concentration finale de 10 ng/mL et de la doxycycline à une concentration finale de 4 μg/mL. De plus, ajouter de la cytosine β-D-arabinofuranoside à une concentration de 2 μM.
REMARQUE : La cytosine β-D-arabinofuranoside est ajoutée au milieu pour inhiber la prolifération des astrocytes et pour tuer les hiPSC restants qui ne se différencient pas en neurones.
- Filtrez le fluide et faites-le chauffer à 37 °C. Aspirez le fluide usé des puits des MEA à 6 puits et de la plaque à 24 puits et remplacez-le par le milieu préparé. Maintenez les AEM à 6 puits et la plaque à 24 puits dans un incubateur humidifié à 37 °C avec une atmosphère à 5 % de CO2.
- Actualiser le support (jours 6 - 28)
REMARQUE : À partir du jour 6, rafraîchissez la moitié du milieu tous les deux jours. À partir du 10e jour, le milieu est complété par le FBS pour soutenir la viabilité des astrocytes.
- Préparez un milieu neurobasal avec un supplément de B-27 à 2 % (v/v), 1 % (v/v) de L-alanyl-L-glutamine et 1 % (v/v) de pénicilline/streptomycine. Ajouter du NT-3 à une concentration finale de 10 ng/mL, du BDNF à une concentration finale de 10 ng/mL et de la doxycycline à une concentration finale de 4 μg/mL. À partir du 10e jour, complétez également le milieu avec 2,5 % (v/v) de FBS. Filtrez le fluide obtenu et réchauffez-le à 37 °C.
- À l’aide d’une pipette de 1000 μL, prélever la moitié du fluide usé des puits des puits des MEA à 6 puits et de la plaque à 24 puits et la remplacer par le milieu préparé. Maintenez les AEM à 6 puits et la plaque à 24 puits dans un incubateur humidifié à 37 °C avec une atmosphère à 5 % de CO2.
