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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation de boules de neurones en tant que culture de gouttes suspendues (Jours in vitro (DIV) 0-3)
NOTE : Les procédures décrites ici pour la préparation de la culture de boules de neurones sont basées sur la méthode précédemment rapportée par le groupe de Sasaki avec quelques modifications. Nous avons également adopté plusieurs procédures de la méthode Banker pour la culture dissociée.
- Confirmer les points suivants avant de commencer la dissection
- Préparez toutes les solutions nécessaires et stérilisez-les à l’avance par autoclave/filtration.
- Gardez à portée de main tous les instruments et matériaux à utiliser à chaque étape de cette culture de neurones corticaux.
- Vaporisez et essuyez l’armoire à flux d’air laminaire, la table de dissection, la plaque de platine du stéréomicroscope, les ciseaux et les pinces avec de l’éthanol à 70 %.
- Euthanasier la souris lors de l’application de CO2 et disséquer l’abdomen pour obtenir des embryons E16.
- Prélever soigneusement la cervelle des embryons à l’aide de fines pointes de pinces et les transférer dans des boîtes de culture cellulaire de 60 mm contenant 4 ml d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinééthanesulfonique, solution saline tamponnée HEPES (HBSS).
note: Le milieu de dissection HBSS contient 10 mM d’HEPES (pH 7,4), 140 mM de chlorure de sodium (NaCl), 5,4 mM de chlorure de potassium (KCl), 1,09 mM d’hydrogénophosphate disodique (Na2HPO4), 1,1 mM de dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4), 5,6 mM de D-glucose et 5,64 μM de rouge de phénol.
- Retirez le cuir chevelu, coupez le bulbe olfactif, séparez les cortex de chaque hémisphère cérébral à l’aide des pointes fines de pinces sous un stéréomicroscope et transférez-les dans une autre boîte de 60 mm contenant du HBSS frais. Utilisez au moins 3 à 5 embryons pour chaque culture de boule de neurone séparée.
- Coupez les cortex en petits morceaux à l’aide de ciseaux à ressort de microdissection dans une hotte de culture cellulaire à flux laminaire.
- Transférez les cortex hachés dans un tube de 15 mL et trypsinisez les cortex hachés dans 4 mL de trypsine à 0,125 % dans HBSS pendant 4,5 min dans un bain-marie à 37 °C
note: Ce temps de trypsinisation est essentiel pour une culture efficace des neurones, car le temps croissant (> 4,5 minutes) conduit à beaucoup plus de neurones morts.
- Transvasez les agrégats cellulaires dans un nouveau tube de 15 mL contenant 10 mL de HBSS à l’aide d’une pipette de transfert stérile et incubez à 37 °C pendant 5 min. Répétez cette étape une fois de plus.
- Transférez les agrégats cellulaires dans un nouveau tube de 15 ml contenant 2 ml de milieu neurobasal contenant du GlutaMax, un supplément de B27 (milieu NGB), 0,01 % de DNase I et 10 % de sérum de cheval.
- Triturez les cortex trypsinisés en les pipetant de haut en bas (3 à 5 fois) à l’aide d’une pipette Pasteur en verre fin poli au feu.
note: Le diamètre d’une pipette Pasteur en verre fin poli au feu est très important, comme décrit dans l’article sur la méthode Banker. Si la pipette est trop étroite pour laisser passer les cortex, préparez des pipettes possédant 2 ou 3 tailles différentes et essayez à partir d’une pipette plus grande.
- Pour préparer des boules de neurones, prenez la suspension cellulaire ci-dessus et ajustez la densité cellulaire à 1 x 106 cellules/ml à l’aide d’un milieu NGB.
- Cultivez les neurones corticaux sous forme de gouttes suspendues contenant 10 000 cellules/goutte (1 goutte correspond à 10 μL) à l’intérieur des paupières supérieures de boîtes de culture de 10 cm.
- Ajouter 7 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans la partie inférieure des boîtes de culture, puis conserver dans un incubateur pendant 3 jours à 37 °C avec 5 % de CO2 dans des conditions humidifiées pour permettre la formation de boules de neurones.