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1. Culture Préparation du neurone ganglionnaire de la racine dorsale adulte dissocié ou du neurone DRG
- Avant de mettre en place la culture, pré-enduire une plaque de 6 puits de poly-D-lysine et de laminine. Incuber une plaque à 6 puits avec 0,01 % de poly-D-lysine à 37 °C pendant 2 h ou à 4 °C pendant la nuit. Ensuite, lavez la plaque deux fois avec de l’eau distillée.
- Incuber la plaque avec une solution de laminine à une concentration de 3 μg/mL pendant 2 h à température ambiante, puis laver la plaque deux fois avec de l’eau distillée. Faites sécher la plaque à température ambiante pendant au moins 1 h.
- Euthanasier une souris dans une chambre de CO2 transparente reliée à une bouteille de gaz CO2 comprimé. Incisez la peau recouvrant la colonne vertébrale avec une lame chirurgicale et disséquez les muscles paravertébraux bilatéralement pour exposer les os vertébraux. Retirez méticuleusement les os vertébraux à l’aide d’un rongeur chirurgical à bout étroit jusqu’à ce que les DRG soient complètement exposés.
note: Les neurones DRG adultes sont obtenus à partir de souris mâles C57BL6 adultes âgées de 8 à 12 semaines.
- Retirez les DRG bilatéralement du S1 jusqu’au niveau C1 à l’aide de ciseaux d’iridectomie et d’une pince à pointe fine sous un microscope de dissection. Essayez de découper entièrement les racines des DRG afin de minimiser la contamination des cellules de Schwann ou des fibroblastes.
- Conservez les DRG disséqués dans une boîte de Pétri de 60 mm contenant 5 ml de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) froid sur de la glace jusqu'à ce que tous les DRG constituent la prochaine étape, même s'il reste encore des DRG collectés.
note: Il est essentiel de disséquer les DRG le plus rapidement possible. La collecte de tous les DRG d’une souris ne doit pas prendre plus de 30 min. 30 min après l’euthanasie, arrêtez de collecter les DRG et procédez au transfert des DRG dans un tube Eppendorf de 1,5 mL à l’aide d’une pointe de pipette bleue (1000 μL) avec une extrémité coupée. Retirez le DMEM après un essorage rapide de plusieurs secondes à l’aide d’une mini centrifugeuse. Ajouter 1 mL de DMEM contenant 125 U/mL de collagénase de type XI et incuber le tube pendant 90 min avec une rotation douce (35-40 tr/min) à l’aide d’un agitateur twister dans un incubateur à 37 °C. Immobilisez le tube sur le sol de l’agitateur à l’aide du ruban adhésif.
- Jeter le DMEM contenant de la collagénase et ajouter 1 mL de DMEM frais. Attendez que les DRG flottants coulent complètement au fond, puis retirez le DMEM avec les débris de tissu. Répétez cette étape de lavage au moins six fois.
note: N’essayez pas de jeter complètement le surnageant. Veillez à ne pas supprimer de DRG avec le DMEM surnageant.
- Transférez les DRG dans un tube conique de 15 mL à l’aide d’une pointe de pipette bleue (1000 μL) avec une extrémité coupée. Ensuite, pipetez doucement de haut en bas au moins 15 fois à l’aide d’un embout bleu (1000 μL) pour obtenir une suspension cellulaire homogène. Évitez de faire des bulles et essayez de ne pas toucher le fond du tube conique avec une pointe de pipette.
- Centrifugez le tube à 239 x g pendant 3 min et jetez soigneusement le surnageant avec les débris flottants. Ajouter 1 mL de milieu Neurobasal complété par de la vitamine B27 (2,0 % v/v) et remettre la pastille cellulaire en suspension en pipetant doucement de haut en bas 5 à 10 fois.
- Faites passer la suspension cellulaire à travers une crépine de cellule de 70 μm superposée sur un tube conique de 50 ml. Attendez 2 min, puis versez le milieu Neurobasal/B-27 sur la passoire à l’aide d’un contrôleur de pipette.
- Plaquez tous les neurones DRG collectés (environ 2 x 106 neurones DRG d’une souris) sur deux puits de plaque à 6 puits. Les neurones DRG d’une souris adulte recouvrent deux puits dans une plaque à 6 puits. Placez ensuite la plaque dans un incubateur de CO2 à 37°C jusqu’à ce que les macrophages se co-cultivent.
2. Co-culture de macrophages péritonéaux primaires sur un insert de culture cellulaire
REMARQUE : Établir les co-cultures 4 h après le placage initial des neurones DRG dissociés
- Les macrophages péritonéaux primaires sont préparés à partir de souris mâles C57BL6 adultes âgées de 8 à 12 semaines. Euthanasier un animal dans une chambre à CO2. Incisez délicatement la peau abdominale, exposez le péritoine et évitez de couper le péritoine pour éviter les fuites de liquide de lavage.
- Perforez le péritoine à l’aide d’une seringue avec une aiguille 22G et injectez 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée dans la cavité péritonéale. Massez doucement le péritoine pendant 1 à 2 min. Ensuite, retirez l’aiguille et pressez le PBS à travers le site de ponction de l’aiguille, puis recueillez le liquide de lavage dans un tube conique de 50 ml.
note: Avant utilisation, mettez la seringue sur de la glace pour maintenir la froideur du PBS.
- Centrifuger le liquide de lavage à 239 x g pendant 10 min à 4 °C pour granuler les composants cellulaires. Remettre la pastille en suspension avec 3 ml de tampon de lyse des globules rouges (GR) pendant 3 min à température ambiante. Ensuite, centrifugez à nouveau la suspension cellulaire à 239 x g pendant 10 min à 4 °C. Remettez la pastille en suspension avec 3 mL de PBS et centrifugez à nouveau la suspension cellulaire pour éliminer tout tampon de lyse des globules rouges restant.
note: Assurez-vous que le tampon de lyse des globules rouges est complètement éliminé. Sinon, le tampon de lyse des globules rouges restants pourrait être toxique pour les macrophages en culture.
- Remettre en suspension les cellules granulées dans 1 mL de milieu Neurobasal/B-27. Plaquez la moitié de tous les macrophages collectés (un total de 3 × 106 à 6 x 106 cellules) sur un insert de culture cellulaire d’une surface efficace de 4,2cm2, qui est placé au-dessus du puits de DRG.
dissocié
note: Pendant la période de co-culture, les macrophages sont cultivés dans le milieu de culture neuronale Neurobasal/B-27. La survie adéquate des macrophages dans cette condition a été confirmée.
3. Traitement de l’AMPdb-c (AMP dibutyryl-cyclique) et prélèvement du macrophage CM
REMARQUE : Commencer le traitement par db-cAMP 4 h après les co-cultures neurones-macrophages.
- Ajouter 2 μL de solution d’AMPdb-c de 100 μM aux co-cultures neuron-macrophages. Ajouter le même volume de PBS pour une expérience de contrôle.
- Après 24 h, remplissez un puits vide avec 1 mL de milieu de culture de macrophages dans la même plaque à 6 puits. Transférez l’insert de culture cellulaire dans les co-cultures neuron-macrophage dans le puits vide avec un milieu de culture de macrophages. Conservez les cellules dans le même état pendant 72 heures sans changer de support.
note: Nous ajoutons seulement 1 mL de milieu de culture de macrophages pendant la collecte de CM pour obtenir un concentré de CM. Lors de la collecte de CM, si nécessaire, nous en avons ajouté plus pour couvrir complètement les macrophages à l’intérieur de l’insert.
- Après 72 h, centrifuger le macrophage CM à 239 x g pendant 5 min pour éliminer les composants cellulaires. Passez le surnageant à travers un filtre de 0,2 μm pour éliminer tous les débris cellulaires restants. Conservez le CM collecté à -70 °C jusqu’à utilisation.