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1. Traitement du Db-Camp et collecte du milieu conditionné par les macrophages
REMARQUE : Commencer le traitement par AMPdb-c 4 h après les co-cultures neurones-macrophages.
- Ajouter 2 μL de solution d’AMP dibutyrylcyclique 100 μM (db-cAMP) aux co-cultures neurones-macrophages. Ajouter le même volume de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour une expérience de contrôle.
- Après 24 h, remplissez un puits vide avec 1 mL de milieu de culture de macrophages dans la même plaque à 6 puits. Transférez l’insert de culture cellulaire dans les co-cultures neuron-macrophage dans le puits vide avec un milieu de culture de macrophages. Maintenir les cellules dans le même état pendant 72 h sans changer de milieu.
note: Nous ajoutons seulement 1 mL de milieu de culture de macrophages lors de la collecte du milieu conditionné (CM) pour produire un concentré de CM. Lors de la collecte de CM, si nécessaire, nous en avons ajouté plus pour couvrir complètement les macrophages à l’intérieur de l’insert.
- Après 72 h, centrifuger le macrophage CM à 239 x g pendant 5 min pour éliminer les composants cellulaires. Passez le surnageant à travers un filtre de 0,2 μm pour éliminer tous les débris cellulaires restants. Conservez le CM collecté à -70 °C jusqu’à utilisation.
2. Essai de croissance des neurites avec CM collecté
- Avant de mettre en place une culture de neurones DRG adultes distincte, pré-enduire une lame à 8 chambres de poly-D-lysine et de laminine. Incuber une plaque à 6 puits avec 0,01 % de poly-D-lysine à 37 °C pendant 2 h ou à 4 °C pendant la nuit. Ensuite, lavez la plaque deux fois avec de l’eau distillée.
- Incuber la plaque avec une solution de laminine à une concentration de 3 μg/mL pendant 2 h à température ambiante, puis laver la plaque deux fois avec de l’eau distillée. Séchez la plaque à température ambiante pendant au moins 1 h.
- Obtenez des neurones DRG adultes dissociés dans un milieu neurobasal complété par de la B27. Plaquez 5 x 104 cellules par puits sur la lame de chambre pré-enduite à 8 puits.
- Placez la lame de chambre dans un incubateur à 37 °C pendant 2 h, en laissant les cellules se fixer au fond. Ensuite, remplacez le milieu de culture par le CM décongelé qui est préchauffé à 37 °C.
note: Veillez à ne pas toucher le fond de la lame de chambre à 8 puits lorsque vous retirez le milieu de culture et ajoutez le CM collecté.
- 15 h après le placage initial, retirez le milieu et lavez une fois les cellules avec du PBS. Ensuite, ajoutez 200 μL de solution glacée de paraformaldéhyde à 4 % dans les puits et incubez les cellules avec la solution de paraformaldéhyde pendant 20 min à 4 °C
note: La culture de neurones DRG pour le test de croissance des neurites doit être précisément limitée à 15 h. Dans cette condition, il n’y a pas d’excroissance notable de neurite.
- Laver trois fois avec du PBS glacé, puis effectuer un blocage avec du sérum de chèvre normal (NGS) à 10 % avec du Triton-X à 0,1 % pendant 30 min. Incuber les cellules fixées avec une solution d’anticorps primaires (anti-Tuj-1) diluée avec 10 % de NGS (à une concentration de 1 μg/mL) pendant 4 h à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C.
- Laver trois fois avec du PBS, puis incuber les cellules avec une solution d’anticorps secondaires (chèvre-anti-souris) pendant 2 h à température ambiante. Ensuite, laver deux fois avec du PBS et monter la lame de culture avec une lamelle (24 × 50 mm) à l’aide d’une solution de montage.
- Prenez des images à l’aide d’un microscope à fluorescence pour visualiser l’excroissance des neurites (Figure 1).
