Utilisation d’un milieu conditionné par des macrophages pour favoriser l’extension des neurones

Résumé

Source : Yun, H. J., et al. Co-cultures neurones-macrophages pour activer les macrophages sécrétant des facteurs moléculaires avec une activité de croissance des neurites. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo présente un test pour favoriser la croissance des projections de neurones connues sous le nom de croissance des neurites en utilisant le milieu conditionné par les macrophages. Co-cultivez des neurones et des macrophages avec l’AMPc et récoltez le milieu conditionné dérivé des macrophages. La croissance des neurones avec le milieu conditionné favorise les excroissances de neurites. Ces excroissances sont marquées par fluorescence et visualisées à l’aide d’un microscope à fluorescence.

Protocole

1. Traitement du Db-Camp et collecte du milieu conditionné par les macrophages

REMARQUE : Commencer le traitement par AMPdb-c 4 h après les co-cultures neurones-macrophages.

1. Ajouter 2 μL de solution d’AMP dibutyrylcyclique 100 μM (db-cAMP) aux co-cultures neurones-macrophages. Ajouter le même volume de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour une expérience de contrôle.
2. Après 24 h, remplissez un puits vide avec 1 mL de milieu de culture de macrophages dans la même plaque à 6 puits. Transférez l’insert de culture cellulaire dans les co-cultures neuron-macrophage dans le puits v....

Résultats

Figure 1 : Résultats représentatifs du dosage de l’excroissance des neurites à l’aide d’un milieu conditionné obtenu dans diverses conditions. (A, B) Les neurones DRG adultes ont été dissociés de manière aiguë et cultivés pendant exactement 15 h. 2 h après le placage, le milieu de culture a été remplacé par un milieu conditionné (CM) obtenu à partir de co-cultures neurones-macrophages traitées.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Insert de culture cellulaire membrane PET transparente de 0,4 μm de taille de pores	Corning,Faucon	Référence 353090	Membrane PET transparente avec une taille de pores de 0,4 μm, pour plaque à 6 puits
Crépine à cellules en nylon de 70 μm	Corning, Faucon	Référence 352350
Lame de culture à 8 puits	Biocoat	354632	avec une application uniforme de Poly-D-Lysine
Milieu neurobasal	Thermo Fisher Scientific, Gibco	Référence 21103-049	Contient 1 % de glutamax et 1 % de péniciline-streptomycine
Supplément de B-27, sans sérum	Thermo Fisher Scientific, Gibco	Référence 17504-044	Solution extracellulaire
Glutamax	Thermo Fisher Scientific, Gibco	Référence 35050-061
Pénicilline-streptomycine	Thermo Fisher Scientific, Gibco	Référence 15140-122
Bromhydrate de poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407-5MG
Laminine	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	Référence 23017-015
Adénosine 3', 5'-monophosphate cyclique, N6,O2'-dibutyryl-, sel de sodium	Merck Millipore Corporation, Calbiochem	Référence 28745
10 % Sérum de Chèvre Normal	Thermo Fisher Scientific	16210072
Triton-X-100	Daejung Chemical and Metal Co	Référence 8566-4405
Tubuline anti β III (Tuj-1)	Promega Corporation	Réf. G7121	Anticorps monoclonal de souris
Anticorps secondaire anti-IgG de souris (H+L) de chèvre	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	A11005
Hémacytomètre	Marienfeld-Superior	n/a
Incubateur CO2 pour la culture cellulaire	Panasonic	n/a
Centrifugeuse de table	Sorvall	n/a
Microscope confocal	Olympus Amérique Inc	IX71
FBS (Sérum de Bovin Fœtal)	VWR International, Hyclone	SH30919.03