Suivi du transport axonal d’organites dans les motoneurones à l’aide d’un dispositif microfluidique

Résumé

Source : Altman, T., et al. Transport axonal des organites dans les cultures de motoneurones à l’aide du système de chambres microfluidiques. J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo présente une méthode de suivi du transport axonal dans les motoneurones à l’aide d’un système de chambre microfluidique. Il s’agit de cultiver des tissus embryonnaires de la moelle épinière de souris dans des puits recouverts de polymères avec un milieu nutritif pour induire la croissance axonale. Le mouvement des organites colorés par fluorescence dans l’imagerie en direct confirme le transport axonal bidirectionnel.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation de la chambre microfluidique ou MFC

1. Coulée PDMS dans des moules primaires (Figure 1)
   1. Achetez ou créez des moules primaires (wafers) selon un protocole détaillé.
   2. Utilisez de l’air sous pression pour éliminer tout type de saleté de la plate-forme de plaquette avant de passer à l’étape d’enrobage. La surface des plaquettes doit être lisse et claire.
   3. Remplissez un r....

Résultats

Figure 1 : Préparation du moule en silicone. Schéma décrivant la procédure de nettoyage des plaquettes de chlorotriméthylsilane. (A) Tout d’abord, 50 mL d’azote liquide ont été ajoutés dans un contenant approprié. À l’aide d’une cagoule chimique, une seringue et une aiguille ont permis d’extraire 8 ml d’azote liquide. Tout le contenu de la seringue a été injecté dans le flacon.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
35mm Fluodish – plat à fond en verre	World Precision Instruments WPI	Réf. FD35-100
50mm Fluodish – plat à fond en verre	World Precision Instruments WPI	Réf. FD5040-100
Caméra Andor iXon DU-897 EMCCD	Andor
ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside)	Sigma-Aldrich	Vers 1768	stock de 2mM en DDW filtré
Supplément B-27 (50X)	Thermo Fisher	17504044
Le BDNF	Laboratoires Alomone	Le B-250	Diluer à 10 μg/mL dans de la ddw filtrée avec 0,01 % BSA)
Poinçon de biopsie 1,25 mm	World Precision Instruments WPI	Référence 504530	Pour la préparation de grands MFC
Poinçon à biopsie 6mm	World Precision Instruments WPI	504533	Pour la préparation de petits MFC
Poinçon de biopsie 7mm	World Precision Instruments WPI	504534	Pour la préparation de grands MFC
Logiciel Bitplane Imaris - version 8.4.1	Imaris
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	#A3311-100G	5 % p/v en DDW
Chlorotrimétylsilane	Sigma-Aldrich	#386529-100ML
Le CNTF	Laboratoires Alomone	C-240	Diluer à 10 μg/mL dans de la ddw filtrée avec 0,01 % BSA)
Gradient de densité moyen - Optiprep	Sigma-Aldrich	D1556
Désoxyribonucléase I (DNAse) du pancréas bovin	Sigma-Aldrich	DN-25	stock 10mg/mL dans le neurobasal
Graisse silicone sous vide poussé Dow Corning	Sigma-Aldrich	Z273554-1EA	Pour la préparation des moules époxy
DPBS 10X	Thermo Fisher	Réf. 14200-067	Diluer 1:10 en DDW
Pince fine Dumont #55 0.05 × 0.02 mm	F.S.T	1125520
Durcisseur époxy	Trias Chem S.R.L	IPE 743	Pour la préparation des moules époxy
Résine époxy	Trias Chem S.R.L	RP 026UV	Pour la préparation des moules époxy
Logiciel FIJI	ImageJ
GDNF	Laboratoires Alomone	G-240	Diluer à 10 μg/mL dans de la ddw filtrée avec 0,01 % BSA)
Glutamax 100X	Thermo Fisher	Réf. 35050-038
HB9 : Souche de souris GFP	Laboratoires Jackson	Référence 5029
HBSS 10X	Thermo Fisher	Réf. 14185-045	Diluer 1:10 dans ddw avec ajout de 1 % P/S et filtre
Logiciel iQ	Andor
Ciseaux à iris, courbés, 10 cm	AS Medizintechnik	Référence 11-441-10
Ciseaux à iris, droits, 9 cm	AS Medizintechnik	Référence 11-440-09
Laminine	Sigma-Aldrich	#L-2020
L-15 moyen de Leibovitz	Thermo Fisher	11415064
LysoTracker Rouge	Thermo Fisher	L7528
Mitotracker Rouge Profond FM	Thermo Fisher	Référence M22426
Milieu neurobasal	Thermo Fisher	21103049
Micorscope Nikon Eclipse Ti	Nikon
Solution de pénicilline-streptomycine (P/S)	Industries biologiques	Référence 03-031-1
Poly-L-Ornithine (PLO)	Sigma-Aldrich	#P8638	Dilué 1:1000 dans flitered 1X PBS
Kit élastomère de silicone Sylgard 184	DOW Corning Corporation	#3097358-1004
Ciseaux de microdissection à ressort Vannas, lame de 3 mm	F.S.T	Référence 15000-00

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