Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation de la chambre microfluidique ou MFC
- Coulée PDMS dans des moules primaires (Figure 1)
- Achetez ou créez des moules primaires (wafers) selon un protocole détaillé.
- Utilisez de l’air sous pression pour éliminer tout type de saleté de la plate-forme de plaquette avant de passer à l’étape d’enrobage. La surface des plaquettes doit être lisse et claire.
- Remplissez un récipient de 50 ml d’azote liquide. Préparez une seringue de 10 ml et une aiguille de 23 g.
note: Toutes les procédures à partir de cette étape doivent être effectuées dans une hotte chimique.
- Dans la hotte chimique, utilisez la seringue et l’aiguille pour accumuler 2 mL d’azote liquide. Bien qu’il puisse sembler que l’air a été aspiré, la seringue est remplie d’azote (Figure 1A). Placez la plaque contenant la plaquette dans un récipient refermable.
- Vissez un flacon de chlorotriméthylsilane, percez le capuchon en caoutchouc à l’aide de la seringue remplie d’azote et injectez tout le contenu de la seringue dans le flacon. Sans retirer l’aiguille, retournez le flacon et prélevez 2 mL de chlorotriméthylsilane.
note: En raison de la pression de la seringue, une petite quantité de chlorotriméthylsilane est pulvérisée hors de l’aiguille. Pour éviter tout danger, pointez l’aiguille vers la paroi intérieure du capot (Figure 1B).
- Répartir le chlorotriméthylsilane uniformément dans le récipient (à partir de l’étape 1.1.4), mais pas directement sur la plaquette ou la plaque contenant une plaquette. Fermez le récipient et incubez pendant 5 min par wafer.
note: Si c’est la première fois que la plaquette est enrobée de chlorotriméthylsilane, une incubation de 1 h doit être autorisée pour chaque plaquette.
- Ne sortez pas les plaquettes et le récipient du capot chimique pendant 30 min
prudence: Le chlorotriméthylsilane est très volatil.
- Peser la base PDMS (voir le tableau des matériaux) dans un tube de 50 mL et ajouter l’agent de durcissement PDMS dans un rapport de 16:1, respectivement (par exemple, 47,05 g de base et 2,95 g d’agent de durcissement). Mélanger pendant 10 min à l’aide d’un rotateur à basse vitesse.
- Versez le PDMS dans chaque plaque contenant une plaquette à la hauteur souhaitée (Figure 1C).
note: L’utilisation de chambres microfluidiques minces (jusqu’à 3-4 mm) améliore l’adhérence à la boîte de culture et empêche les fuites.
- Placez toutes les plaques ensemble à l’intérieur d’un dessiccateur sous vide pendant 2 h (Figure 1E). Ce processus élimine l’air emprisonné à l’intérieur du PDMS, éliminant ainsi les bulles d’air et formant un moule clair et uniforme.
- Placez les plaques dans un four pendant 3 h (ou toute la nuit) à 70 °C (Figure 1E).
note: Les plaques doivent être de niveau lorsqu’elles sont placées dans le four.
- Coulée PDMS dans des moules époxy
note: Étant donné que la préparation des plaquettes est coûteuse, nécessite un équipement spécial et peut endommager les plaquettes fragiles, il est possible de générer des répliques époxy de plaquettes. Les répliques sont moins chères, plus durables et peuvent être utilisées pour la production de masse de chambres microfluidiques.
- Coulez et polymérisez le PDMS (comme décrit aux points 1.1.8-1.1.11) dans la plaquette d’origine.
- Retirez et coupez les parties excédentaires de PDMS, ne laissant que les éléments microfluidiques et la zone fonctionnelle requise pour les traiter dans des chambres microfluidiques.
- Enveloppez immédiatement le PDMS avec du ruban adhésif épais pour éviter qu’il n’accumule de la poussière.
- Choisissez une boîte en plastique de qualité culture tissulaire qui s’adapte à l’ensemble du PDMS à l’intérieur et laissez de la place pour l’époxy autour d’elle. La distance entre le PDMS et la parabole en plastique doit être inférieure à 5 mm.
- Préparez une petite quantité de PDMS mélangé dans un rapport de 10:1 (base : agent de durcissement). Le PDMS liquide frais sera utilisé pour coller le PDMS solide sur le fond de la plaque en plastique.
- Appliquez une quantité minimale de PDMS liquide au centre de la plaque en plastique, puis retirez le ruban adhésif du PDMS et collez-le au fond du plat en plastique. Assurez-vous que les éléments microfluidiques sont orientés vers le haut.
- Laissez durcir le PDMS pendant 30 min dans un four à 70 °C.
- Préparez la résine époxy en mélangeant la base et l’agent de durcissement dans un rapport de 100:45, respectivement dans un tube à essai. Différentes résines époxy peuvent avoir des rapports de mélange différents. Le volume requis pour une plaque régulière de 100 mm est d’environ 40 ml.
- Laissez l’époxy bien se mélanger pendant 10 minutes dans un rotateur jusqu’à ce que le mélange devienne visiblement homogène (c’est-à-dire qu’il n’y a pas d’artefacts visibles ressemblant à des fibres dans le liquide).
- Centrifugez le mélange époxy à 400 x g pendant 5 min pour éliminer les bulles d’air coincées à l’intérieur.
- Pendant la centrifugation, étalez une fine couche de graisse de silicone autour des parois et de toutes les autres parties en plastique exposées de la boîte de culture. Cela empêchera l’époxy de polymériser avec le plastique de la boîte et permettra d’éliminer facilement l’époxy durci à la fin du protocole.
- Versez lentement l’époxy dans le plat jusqu’à ce qu’il recouvre complètement le PDMS et le dépasse d’au moins 5 mm. Évitez la formation de bulles à l’intérieur de l’époxy en ne gardant aucune distance entre le tube et la plaque. Placez la plaque dans un endroit sûr afin qu’elle ne soit pas déplacée pendant les prochaines 48 heures.
- Après 48 h, l’époxy devrait être complètement durci. Insérez la plaque dans un four préchauffé à 80 °C pendant 3 h pour le durcissement final.
- Retirez l’époxy durci de la plaque et du moule PDMS d’origine en tirant doucement sur la paroi en plastique de la plaque jusqu’à ce qu’elle se brise. Il devrait ensuite se séparer facilement de l’époxy et se décoller.
- Une fois extraite, essuyez la graisse restante de la nouvelle réplique époxy et insérez-la à l’envers (c’est-à-dire avec les éléments microfluidiques répliqués vers le haut) dans une nouvelle boîte de culture. La réplique époxy est maintenant prête pour le moulage PDMS.
- Utilisez de l’air sous pression ou du N2 pour souffler les restes de PDMS ou de saleté du moule époxy et rincez-le 2 fois avec de l’isopropanol. Remplissez-le une troisième fois et incubez pendant 10 min sur une plaque vibrante orbitale. Rincez à nouveau le moule 3 fois avec de l’isopropanol et jetez le liquide restant. Séchez au brushing à l’air ou au N2 ou placez-le dans un four à 70 °C jusqu’à ce qu’il soit sec.
note: Suivez les procédures de sécurité lorsque vous travaillez avec de l’isopropanol et que vous le jetez.
- Gardez les plaques du moule fermées jusqu’à la coulée. Suivez les étapes 1.1.8.-1.1.11.
- Poinçonnage et sculpture du PDMS dans un MFC (Figure 2)
- Découpez et retirez le moule PDMS de la plaque en suivant les marques (+) sur les plaquettes à l’aide d’un scalpel. N’utilisez pas de force, car les moules sont fragiles (Figure 2A).
- Suivez les instructions dessinées sur le croquis pour poinçonner et découper les chambres en fonction de la configuration expérimentale (Figure 2B-F).
- Pour la culture d’explants de moelle épinière (figures 2C, E), perforer deux puits de 7 mm dans la face distale du grand MFC. Localisez les puits de manière à ce qu’ils chevauchent les bords des canaux. Du côté proximal, enfoncez bien un de 7 mm au milieu du canal, avec un chevauchement minimal, de sorte qu’il reste suffisamment d’espace pour les explants. Percez deux trous supplémentaires de 1 mm dans les deux bords du canal proximal. Tournez le MFC avec les éléments microfluidiques vers le haut, et à l’aide d’une aiguille de 20 G, sculptez trois petites grottes d’explant sur le puits perforé de 7 mm.
- Pour la culture de MN dissociée (Figure 2D, F), percer quatre puits de 6 mm dans les bords des deux canaux d’un petit MFC.
- Stérilisation du MFC pour la culture tissulaire
- Étalez des bandes de ruban adhésif de 50 cm de long sur le banc. Appuyez et tirez la chambre vers l’arrière pour faire face au ruban adhésif (faces supérieure et inférieure) et enlever la saleté grossière. Placez les chambres propres dans une nouvelle plaque de 15 cm.
note: N’appuyez pas directement sur les éléments microfluidiques lorsque ceux-ci sont orientés vers le haut.
- Incuber les chambres dans de l’éthanol à 70 % de qualité analytique pendant 10 min sur un agitateur orbital.
- Jetez l’éthanol et séchez les chambres dans une hotte de culture tissulaire ou dans un four à 70 °C.
- Placer le MFC sur un plat à fond en verre
- Placez la chambre au centre d’un plat à fond en verre de 35 mm/50 mm de qualité culture tissulaire et appliquez une force mineure sur les bords pour que le PDMS et le fond du plat se lient. Pour éviter de casser le fond du verre, appliquez toujours une force sur une surface solide.
- Incuber pendant 10 min à 70 °C. Presser les chambres pour renforcer l’adhérence à la plaque.
- Incuber sous lumière UV pendant 10 min.
- Enrobage et culture
- Ajouter 1,5 ng/mL de poly-L-ornithine (PLO) dans les deux compartiments. Assurez-vous que le PLO passe à travers les canaux en pipetant plusieurs fois le support de revêtement directement dans l’entrée du canal.
- Examinez la chambre microfluidique au microscope optique avec un grossissement de 10x pour vérifier la présence de bulles d’air. Si des bulles d’air bloquent les microsillons, placez le MFC dans un dessiccateur sous vide pendant 2 min. Plus tard, éliminez l’excès d’air qui s’est coincé dans les canaux en pipetant le support de revêtement à travers ceux-ci. Incuber toute la nuit.
- Remplacer le PLO par de la laminine (3 μg/mL en JAD) pour l’incubation pendant la nuit de la même manière.
- Avant le placage, lavez la laminine avec un milieu de culture neuronal.
2. Placage de culture neuronale
- Culture d’explants de moelle épinière
- À l’aide de ciseaux droits et de pinces fines, disséquez une moelle épinière à partir d’un embryon de souris E12.5 ICR-HB9 :GFP. Agir dans une solution 1X HBSS avec 1 % de pénicilline-streptomycine (P/S) (figure 3A-C).
- À l’aide de ciseaux de microdissection, retirez les méninges et les cornes dorsales (Figure 3D).
- Coupez la moelle épinière en sections transversales de 1 mm d’épaisseur (Figure 3E). Jetez tout le milieu du compartiment proximal du MFC.
- Prélever un seul explant de moelle épinière à l’aide d’une pipette d’un volume total de 4 μL. Injecter l’explant le plus près possible de la grotte et aspirer tout excès de liquide du puits proximal par les sorties latérales (poinçons de 1 mm). Les explants doivent être aspirés dans le canal proximal.
- Ajouter lentement 150 μL de milieu d’explant de moelle épinière (SCEX, voir le tableau des matériaux et le tableau 3) dans le puits proximal.
- Entretien de la culture d’explants de moelle épinière
- Ajouter un milieu SCEX dans le compartiment proximal et un milieu SCEX riche (SCEX avec 50 ng/mL de BDNF et GDNF) dans le compartiment distal. Maintenir un gradient de volume d’au moins 15 μL par puits entre les puits distaux (volume plus élevé) et le puits proximal.
- Rafraîchissez le support tous les 2 jours. Les axones peuvent prendre jusqu’à 3 à 5 jours pour se croiser distalement.
3. Transport axonal (Figure 4A)
- Marquage des mitochondries et des compartiments acides
- Préparez un milieu SCEX frais (ou CNB pour MN dissocié) contenant 100 nM Mitotracker Deep Red FM et 100 nM LysoTracker Red. Incuber pendant 30 à 60 min à 37 °C. D’autres couleurs peuvent être utilisées à condition que leurs fluorophores ne se chevauchent pas.
- Laver 3 fois avec un support chaud CNB/SCEX. Les plaques sont prêtes pour l’imagerie.
- Imagerie en direct
- Acquisition de 100 séries d’images en accéléré du transport axonal à des intervalles de 3 s, avec un total de 5 min par film.
note: Le système d’imagerie utilisé dans cette étude comprenait un microscope inversé équipé d’un disque rotatif confocal, contrôlé par un logiciel d’imagerie cellulaire propriétaire, une lentille d’huile 60x, NA = 1,4, et une caméra EMCCD. Les films ont été acquis dans un environnement contrôlé à 37 °C et 5 % de CO2,
note: Des vidéos time-lapse plus ou moins longues peuvent être imagées, selon l’expérience. Même des films de nuit peuvent être enregistrés si nécessaire. Cependant, il est essentiel d’essayer de réduire le temps d’exposition et la puissance laser, ainsi que le nombre total d’images, afin de diminuer la phototoxicité et le blanchiment lors de l’acquisition de films.
