Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des matériaux
- Stérilisez tous les instruments et le ddH2O à l’aide d’un autoclave avant d’effectuer l’expérience. Les instruments comprennent, sans s’y limiter, des ciseaux chirurgicaux, des ciseaux ophtalmiques, des pinces, des cuillères, des séparateurs de noyau, des plats en verre (60 à 100 mm de diamètre) et des béchers en verre.
- Préparez la solution de Krebs (Tableau 1) : Dissoudre tous les produits chimiques avec du ddH2O avant utilisation. Dissoudre CaCI2 séparément et l’ajouter lentement dans la solution mélangée tout en remuant pour éviter les sédiments.
- Préparez le milieu de rinçage, qui se compose d’un milieu F12 avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % d’antibiotique/antimycosique (100x). Ajouter 5 ml de FBS et 0,5 ml d’antibiotique/antimycosique à 44,5 ml de milieu F12.
- Préparez le milieu neuronal A, qui comprend le milieu neurobasal A avec 2 % de B-27, 1 % de FBS, 1 % de L-glutamine, 1 % d’antibiotique/antimycosique (100x) et 0,1 % de facteur neurotrophique dérivé de la glie (GDNF). Ajouter 200 μL de B-27, 100 μL de FBS, 100 μL de L-glutamine, 100 μL d’antibiotique/antimycosique (100x) et 10 μL de GDNF (10 μg/mL) à 9,5 mL de A media neurobasal.
note: Préparez les milieux neuronaux A dans la semaine suivant l’utilisation pour assurer la fraîcheur de la B-27, de la L-glutamine et du GDNF.
- Préparez le média neuronal B en utilisant la même procédure que la préparation du média neuronal A, mais sans ajouter de FBS.
- Préparez la solution digestive 1 en dissolvant 20 mg de collagénase de type II, 6 mg d’albumine sérique bovine et 200 μL d’antibiotique/antimycosique (100x) dans 10 ml de solution de Krebs stable à l’oxygène.
- Préparez la solution de digestion 2 en diluant 1 mL de trypsine à 0,25 % avec 4 mL de solution saline équilibrée de Hank.
- Préparez une assiette avec des lamelles enduites.
- Utilisez des pinces dans un banc à flux laminaire lorsque vous placez des lamelles de verre dans une plaque de culture à 48 puits.
- Diluer la poly-D-lysine avec de la ddH2O à une concentration de 0,1 mg/mL sous forme de stock de poly-D-lysine. Conservez le bouillon à -20 °C et décongelez avant
- Ajouter 40 μL de poly-D-lysine sur chaque lamelle et incuber la solution à température ambiante pendant 10 min
note: Ajustez la concentration à 4 μg/cm2 pour différentes plaques avec des zones basales différentes. Par exemple, si l’aire basale d’un puits d’une plaque de 24 puits est de 2 cm2, nous devrions transférer 80 μL de stock de poly-D-lysine dans un puits. Chaque cm2 contiendrait 4 μg de poly-D-lysine.
- Retirez la poly-D-lysine dans la plaque à 48 puits et rincez trois fois les lamelles avec du ddH2O.
- Faites sécher la plaque dans une hotte à flux laminaire pendant au moins 30 min pour vous assurer que la plaque est anhydre.
- Conservez la plaque à 4 °C avant l’enrobage de laminine pendant 1 jour au maximum. Il est préférable de stocker la plaque à -20 °C pour un stockage à long terme.
- Décongeler la laminine à 4 °C. Diluer la laminine avec du ddH2O à une concentration de 50 μg/mL sous forme de stock de laminine. Conservez le bouillon à -20 °C et décongelez-le à 4 °C avant utilisation.
- À l’aide d’une pipette, transférez 100 μL de laminine diluée sur le dessus de chaque lamelle et incubez la laminine à 4 °C pendant 1 h
note: Ajustez la concentration à 5 μg/cm2 pour différentes plaques avec différentes zones basales. Par exemple, si l’aire basale d’un puits d’une plaque de 24 puits est de 2 cm2, transférez 200 μL de laminine diluée dans un puits. Chaque cm2 contiendrait 5 μg de laminine.
- Retirez la solution de laminine et rincez une fois les lamelles avec du ddH2O. Effectuez cette opération sur le bord de la lamelle pour éviter de gratter.
note: Les lamelles enrobées peuvent être conservées à 4 °C pendant 2 semaines au maximum.
2. Prélèvement de la vessie
- Obtenez des rats Sprague-Dawley âgés de cinq semaines.
- Faites infuser du carbogène (95 % d’oxygène, 5 % de CO2) dans la solution de Krebs pendant au moins 30 minutes dans un bain de glace pour atteindre un état d’oxygène et un niveau de pH stables.
- Après l’euthanasie par luxation cervicale, faire tremper les rats dans de l’éthanol à 75 % pendant 30 secondes pour la stérilisation.
- Placez les rats sur une serviette chirurgicale stérilisée et exposez leur abdomen. Ouvrez la cavité abdominale et révélez la vessie à l’aide d’un ensemble de ciseaux et de pinces.
- Soulevez doucement la vessie et coupez la vessie du col de la vessie avec une autre paire de ciseaux et de pinces pour éviter la contamination croisée. Placez rapidement la vessie dans une solution de Krebs froide et stable à l’oxygène pour améliorer la survie cellulaire.
note: Une fois la vessie retirée, effectuez rapidement les opérations suivantes pour améliorer les perspectives de survie des neurones.
- Ajouter la solution de Krebs dans trois plats en verre et des béchers en verre.
- Préparez des plats en verre et des béchers avec la solution de Krebs dans un bain de glace pour le pré-refroidissement.
- Marquez ces récipients avec les numéros 1 à 3 correspondants pour éviter toute confusion.
- Associez chaque plat en verre avec une pince et une cuillère à séparateur de noyau.
- Dans un plat en verre 1, ouvrez la vessie avec des ciseaux ophtalmiques et dépliez-la avec une pince et un séparateur de noyau
.
- Rincez la vessie dans le bécher en verre 1 et placez-la dans le plat en verre 2.
- Éliminer la graisse adhérente à la surface des tissus à l’aide de pinces et de ciseaux ophtalmiques dans une boîte en verre 2.
- Rincez la vessie dans le bécher en verre 2 et placez-la dans le plat en verre 3.
- Grattez doucement la vessie à l’aide de la pince et du séparateur de noyau des cuillères sur le plat en verre 3 pour éliminer les attaches exogènes.
- Rincer la vessie dans un bécher en verre 3, transférer la vessie dans un tube à centrifuger de 15 mL avec 14 mL de solution froide de Krebs et faire tourner l’échantillon pendant 1 min à 356 x g et 4 °C.
- Répétez l’étape précédente deux fois dans deux autres tubes avec la solution Krebs pour réduire la contamination.
3. Digestion de la vessie en deux étapes
- Transférez la vessie du tube de centrifugation dans un flacon de 2 ml contenant 1 ml de solution de digestion 1. À l’aide de ciseaux ophtalmiques, coupez la vessie en petits morceaux (moins de 1 mm) dans une solution.
- Mélanger la solution vésicale avec 9 mL de solution de digestion 1 dans une boîte de culture cellulaire stérile (100 mm de diamètre). Effectuez l’étape 1 de la digestion dans un incubateur agitateur pendant 1 h sous 5 % de CO2, 37 °C et 200 tr/min.
- Après l’étape 1 de la digestion, centrifuger la solution à 356 x g à 4 °C pendant 8 min.
- Placez la solution de digestion 2 dans un bain-marie à 37 °C pour le préchauffage.
- Après la centrifugation, retirer le surnageant qui contient la solution de digestion 1 et récolter le sédiment cellulaire. Un peu de liquide restant est autorisé. L’élimination complète de la solution peut favoriser la perte de cellules.
- Mélangez les sédiments cellulaires avec la solution de digestion tiède 2 dans un tube à centrifuger de 15 mL et agitez le mélange pendant la digestion dans un bain-marie à 37 °C pendant 5 min. Ne dépassez pas 7 min de digestion à l’étape 2, sinon les neurones périront.
- Après la digestion, désactiver immédiatement la trypsine dans le mélange avec 10 mL de produit de rinçage à froid.
note: Effectuez les étapes suivantes entre 0 °C et 4 °C. Un bain de glace pourrait fournir de telles conditions.
- Récolter le sédiment cellulaire après centrifugation à 356 x g à 4 °C pendant 8 min. Retirer autant de milieu que possible car la trypsine restante nuit à la croissance cellulaire.
- Remettez doucement en suspension les sédiments avec 3 mL de milieux neuronaux. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est générée dans la solution contenant des cellules pour un taux de survie élevé.
- Filtrez le média de mélange à travers une crépine de 70 μm dans un tube à centrifuger de 50 mL.
- Maintenir le filtrat sur un shaker à 30 tr/min dans un bain de glace pendant 30 min. Cette étape n’est pas nécessaire mais recommandée.
- Prélever les cellules par centrifugation à 356 x g à 4 °C pendant 8 min, et remettre doucement les pastilles cellulaires en suspension dans 1 mL de milieu neuronal A.
- Ajouter 500 μL de mélange cellulaire dans chaque puits de la plaque à 48 puits préparée.
- Cultiver des cellules dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
- Remplacez tous les milieux par des milieux neuronaux B en 1 h pour obtenir une culture sans sérum.
- Changez la moitié du média neuronal B tous les 3 jours.
note: Les neurones sont prêts pour les expériences immunocytochimiques après 5 à 7 jours de culture.
Table 1. Composition de la solution de Krebs
| ingrédients | Molarité (mM) |
| NaCI | 120 |
| Kci | 5.9 |
| NaHCO3 | 25 |
| Na2HPO4·12H2O | 1.2 |
| MgCI2·6H2O | 1.2 |
| CaCI2 | 2.5 |
| glucose | 11,5 |
