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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation et enrobage des copeaux multicompartiments
- Dans une enceinte de biosécurité, placez la puce dans une boîte de Pétri ou un autre récipient stérile approprié.
- Ajoutez 100 μL de solution de pré-enrobage dans le puits supérieur gauche de la puce et laissez-la s’écouler à travers le canal principal dans le puits adjacent.
note: La solution de pré-revêtement est utilisée pour pré-enrober les canaux microfluidiques afin d’éliminer le risque de piégeage des bulles d’air à l’intérieur de la puce.
- Remplissez le puits inférieur gauche avec 100 μL de solution de pré-enrobage. Attendez 5 min pour permettre à la solution de s’écouler à travers les microsillons.
- Ajoutez 100 μL de solution de pré-enrobage dans le puits supérieur droit et laissez-la s’écouler par le canal principal dans le puits adjacent. Remplissez le puits inférieur droit avec 100 μL de solution de pré-enrobage.
- Aspirez la solution de chaque puits. Aspirez à l’écart des canaux principaux pour éviter d’évacuer le liquide des canaux principaux (Figure 1A). Ajouter immédiatement 150 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans le puits supérieur gauche. Attendre 1.5 min.
prudence: N’aspirez pas tout le liquide des canaux principaux fermés.
- Ajoutez 150 μL de PBS dans le puits inférieur gauche. Attendez 5 min pour permettre aux liquides de s’écouler à travers les microsillons. Ajoutez 150 μL de PBS dans le puits supérieur droit. Ajoutez 150 μL de PBS dans le puits inférieur droit. Attendre 10 min.
- Répétez les étapes 1,5-1,6 pour un deuxième lavage PBS.
- Vérifiez la puce sous un microscope de culture tissulaire pour détecter la présence de bulles dans les canaux principaux. Si des bulles sont présentes, effectuez les procédures ci-dessous. S’il n’y a pas de bulles, passez à l’étape 1.9.
- Aspirez le PBS des puits, en inclinant l’extrémité de la pipette loin de l’ouverture du canal (Figure 1A).
- Versez 100 μL de solution de pré-enrobage dans le puits supérieur, en inclinant l’extrémité de la pipette près de l’ouverture du canal (figure 1B). Les bulles doivent se déplacer à travers le canal dans le puits inférieur. Attendre 1,5 min.
- Répétez les étapes 1.3-1.8.
- Aspirez le PBS des puits, en inclinant l’extrémité de la pipette loin de l’ouverture du canal (Figure 1A).
- Ajoutez 100 μL de poly d-lysine (PDL) à 0,5 mg/mL dans le puits supérieur gauche de la puce. Attendre 1,5 min. Remplissez le puits inférieur gauche avec 100 μL de PDL.
- Ajoutez 100 μL de PDL dans le puits supérieur droit de la puce. Attendre 1,5 min. Ajouter 100 μL dans le puits inférieur droit.
- Fermez la boîte de Pétri et placez la puce dans un incubateur à 37 °C pendant 1 h.
- Répétez les étapes de lavage PBS 1,5-1,6 deux fois pour éliminer l’excès de PDL.
- Aspirez le PBS de l’appareil.
- Ajoutez immédiatement 100 μL de milieu de culture cellulaire dans le puits supérieur gauche de la puce. Attendre 1,5 min. Ajoutez du support dans le puits inférieur gauche. Ajoutez du support dans le puits supérieur droit. Attendre 1,5 min. Ajoutez 100 μL de fluide dans le puits inférieur droit de la puce.
- Placez la puce dans l’incubateur à 37 °C jusqu’à ce qu’elle soit prête à plaquer les cellules.
2. Ensemencement de neurones dans les puces à plusieurs compartiments
- Préparez la suspension cellulaire des neurones de l’hippocampe de rat dissociés selon les protocoles établis pour produire une densité de ~12 × 106 cellules/mL.
note: L’utilisation de densités de suspension cellulaire comprises entre 3 et 12 × 106 cellules/mL est possible. Si une densité plus faible est utilisée, le volume de suspension cellulaire à ajouter à la puce peut être augmenté. La procédure décrite ci-dessous s’applique aux neurones murins dissociés du cortex ou de l’hippocampe. Les densités cellulaires optimales pour d’autres types de neurones peuvent varier.
- Retirez la majorité du support dans chaque puits de la puce, en laissant environ 5 μL dans chaque puits. Aspirez à l’écart des canaux principaux pour éviter d’évacuer le liquide des canaux principaux (Figure 1A).
prudence: N’aspirez pas de liquide des canaux principaux fermés. Des bulles d’air peuvent se coincer dans la puce si le fluide est aspiré à partir des canaux principaux.
- Chargez 5 μL de suspension cellulaire dans le puits supérieur droit et 5 μL supplémentaires de suspension cellulaire dans le puits inférieur droit (~120 000 cellules au total). Chargez les cellules en les distribuant à proximité du canal principal (Figure 1B). Vérifiez au microscope pour vous assurer que les neurones sont dans le canal principal. Attendez 5 minutes pour permettre aux cellules de s’attacher.
note: Les neurones peuvent être chargés dans l’un ou l’autre compartiment. À des fins d’explication, le compartiment somatique est le canal principal du côté droit, mais l’un ou l’autre compartiment peut être utilisé comme compartiment somatique. L’utilisation de densités de cellules inférieures jusqu’à 60 000 cellules par puce est possible. Jusqu’à 10 μL de suspension cellulaire peuvent être ajoutés à chaque puits du compartiment somatique en combinaison avec une suspension cellulaire contenant moins de cellules que celle décrite ci-dessus.
- Ajoutez environ 150 μL de milieu de culture neuronal dans chacun des puits supérieur et inférieur droit, puis ajoutez 150 μL de milieu dans chaque puits supérieur et inférieur gauche. Placez la puce dans le plateau humidifié dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C.
- Après 24 h, effectuez un changement de média en retirant le média des puits. Assurez-vous que le canal principal reste rempli. Ajouter 150 μL de média dans chaque puits supérieur, puis remplir les puits inférieurs.
- Remettez la puce dans l’incubateur pendant le nombre de jours souhaité.
note: Surveillez le support tous les quelques jours pour vous assurer qu’il reste rose pâle. Si le support est jaunâtre, remplacez-en 50 % par un support frais. Si le niveau de liquide est bas, assurez-vous d’une humidité adéquate et d’un confinement secondaire approprié des copeaux pour éviter l’évaporation. Il est possible de minimiser ou d’éliminer les changements de média en utilisant un confinement secondaire et/ou en recouvrant la parabole contenant la puce d’un film polytétrafluoroéthylène (PTFE)-FEP.
