Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Préparer des solutions pour les expériences
- Préparez la solution de revêtement de matrice extracellulaire (ECM) (voir le tableau des matériaux) : décongelez le mélange ECM sur de la glace. Diluer le mélange ECM 1:10 dans un milieu de culture de base (sans facteurs neurotrophiques ni sérum de veau fœtal) et stocker sur de la glace.
- Préparez le milieu de culture (voir le tableau des matériaux) : Préparez un stock de milieu neurobasal ne contenant pas de FBS ou de facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF). Complétez le milieu neurobasal avec du FBS frais (10 %) et du BDNF (5 ng/ml) juste avant de l’ajouter à la culture cellulaire.
- Préparez la solution extracellulaire (voir le tableau des matériaux).
2. Lavage et stérilisation des AEM
REMARQUE : Les MEA utilisés pour les expériences contiennent 68 électrodes disposées dans une grille rectangulaire (Figure 1E). Chaque électrode a une taille de 40 x 40 μm2 avec un espacement de 200 μm d’un centre à l’autre. Les électrodes sont en platine. Les électrodes sont reliées aux contacts correspondants par un circuit en oxyde d’indium et d’étain. Ce circuit est isolé par une couche de 5 μm de SU-8. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur le fournisseur. D’autres dispositions MEA peuvent convenir à ces expériences.
- Pour les nouveaux MEA : Rincez-les en les immergeant dans de l’éthanol à 70 % pendant 30 secondes et lavez-les à l’eau distillée pendant 30 secondes. Travaillez dans une hotte à flux laminaire.
- Laissez sécher le MEA pendant 30 min dans une hotte à flux laminaire.
- Placez chaque AEM dans une boîte de Pétri stérile individuelle (35 mm x 10 mm) et scellez-la avec du papier d’aluminium. Les MEA peuvent être stockés jusqu’à ce qu’ils soient utilisés.
- Pour les AEM utilisés : Incuber les AEM dans une boîte de Pétri (35 mm x 10 mm) contenant 1 ml de solution enzymatique (voir le tableau des matériaux) O/N sur un agitateur orbital à RT pour éliminer le matériel biologique. Continuez ensuite comme à l’étape 2.1.
note: Manipulez les MEA avec précaution à l’aide de pinces à pointes recouvertes de caoutchouc.
3. Préparation des AEM pour les expériences de culture
- Retirez la feuille d’étanchéité et laissez le MEA dans la boîte de Pétri (35 mm x 10 mm) pendant toute la durée de l’expérience.
- Enduire les AEM avec la solution préparée en 1.1 : À l’aide d’une pointe de pipette froide de 200 μl (stockée à -20 °C), pipeter 50 μl de solution d’enrobage sur chaque AEM, en couvrant toute la surface de l’électrode.
- Laisser les AEM enrober pendant 30 minutes à 1 heure de réinsertion.
- Retirez la solution d’enrobage à l’aide d’une pipette. Appliquez 100 μl de milieu de culture complété par 10 % de FBS et 5 ng/ml de BDNF et laissez-le à RT jusqu’à ce que le tissu soit placé.
- Placez 2 boîtes de Pétri contenant les AEM enrobés dans une grande boîte de Pétri (94 mm x 16 mm) et ajoutez une troisième petite boîte de Pétri contenant 1,5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour l’humidification.
note: L’ajout d’une petite boîte de Pétri (étape 3.5) contenant du PBS est crucial pour minimiser considérablement l’évaporation du milieu de culture.
4. Dissection ganglionnaire en spirale
REMARQUE : La dissection grossière peut être effectuée à l’extérieur de la hotte à flux laminaire (étapes 4.1 à 4.4). Pour la dissection fine, des conditions stériles (hotte à flux laminaire) sont obligatoires (à partir de l’étape 4.5).
- Euthanasier les animaux (souris âgées de 5 à 7 jours) par décapitation sans anesthésie préalable.
- Stérilisez la tête par pulvérisation d’éthanol à 70 %.
- En tenant la tête, coupez la connexion entre la peau et le crâne avec des ciseaux pointus/pointus le long de la ligne sagittale.
- Coupez le crâne de manière sagittaire et retirez le cerveau à l’aide de ciseaux tranchants/émoussés.
- Coupez les os temporaux du crâne et placez-les dans une boîte de Pétri contenant de la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) stérile et glacée.
- À l’aide d’un microscope de dissection, disséquez la bulle tympanique à l’aide d’une pince fine et isolez l’oreille interne.
- Retirez l’os de la cochlée à l’aide d’une pince fine.
- Retirez le ligament spiralé et la strie vasculaire (SV) ensemble en tenant avec des pinces la partie basale du ganglion spiralé (SG) et le SV et en déroulant lentement le SV de la base à l’apex
- Isolez l’organe de Corti (OC), le SG et le modiolus (Figure 1A-C).
- Séparez le CO du SG et du modiolus en tenant avec des pinces la partie basale du SG et du CO et en déroulant lentement le CO de la base à l’apex.
- Découper des explants latéraux (de 200 à 500 m de diamètre) dans le ganglion spiralé encore attaché au modiolus (Figure 1D) à l’aide d’une pince et d’un micro-scalpel.
5. Culture d’explants de ganglion spiralé sur les AEM
- Placez deux explants ganglionnaires en spirale à côté des électrodes sur le MEA préalablement préparé avec 100 μl de milieu de culture.
- Placez l’organe de Corti à environ 5 mm de la zone de l’électrode.
- À l’aide d’une pince, fixez les explants et l’organe de Corti sur le MEA tout en évitant d’endommager les tissus.
- Placez soigneusement les AEM dans l’incubateur et cultivez-les à 37 °C et 5 % de CO2. Le lendemain, vérifiez visuellement que les explants se sont attachés au MEA.
note: Si les explants n’ont pas fixé O/N, ils le feront rarement au cours des prochains jours. Le CO est placé à côté de la culture pour le soutien trophique/neurotrophique.
- Ajouter 100 μl de milieu de culture contenant 10 % de FBS et de BDNF par jour pendant 5 jours consécutifs.
- Le jour 6, ajouter 2 ml de milieu de culture contenant 10 % de FBS et 5 ng/ml de BDNF et cultiver le tissu pendant 13 jours supplémentaires.
