1. Ensemencement des astrocytes pour la reprogrammation
REMARQUE : Les étapes suivantes doivent être effectuées sous une enceinte de sécurité biologique de niveau de sécurité 1 (SL1).
- Préparez des plaques à 24 puits avec des lamelles en verre recouvertes de poly-D-lysine de la même manière que les flacons de culture ont été préparés précédemment. Pour déterminer le nombre de plaques nécessaires, considérez que les astrocytes sont plaqués à une densité de 5-5,5 x 104 cellules par puits dans une plaque de 24 puits. Habituellement, l’isolement de six moelles épinières de souris postnatales du jour 2 (P2) produit environ 1 x 106 cellules.
- Aspirez le milieu des flacons de culture T25 contenant les astrocytes cultivés et lavez-les une fois avec 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Détachez les astrocytes de la fiole de culture en ajoutant 0,5 mL de trypsine ou d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,05 % et incubez à 37 °C pendant 5 min. Tapotez doucement le côté du ballon pour libérer les cellules de la surface du ballon de culture et vérifiez le détachement au microscope à fond clair à l’aide d’un grossissement de 10X.
- Arrêtez la trypsinisation avec 2,5 mL de milieu de culture d’astrocytes et prélevez la suspension cellulaire dans des tubes de 15 mL. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min, aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu de culture d’astrocytes. Calculez la concentration cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un système de comptage cellulaire automatisé.
- En fonction du nombre de cellules, diluer la suspension cellulaire avec un milieu astrocytaire frais pour obtenir une solution de 1-1,1 x 105 cellules par ml. Compléter le milieu avec du facteur de croissance épidermique (EGF) et du facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF) à raison de 10 ng/mL par facteur. Ajouter 500 μL de suspension cellulaire, soit l’équivalent de 5-5,5 x 10cellules 4, dans chaque puits des plaques à 24 puits et des cellules de culture préalablement préparées à 37 °C et 5 % de CO2.
2. Expression forcée des facteurs de transcription
REMARQUE : Avant de procéder au protocole, il est essentiel de bien concevoir l’expérience. En particulier, il est important de toujours inclure un contrôle négatif pour la reprogrammation, à savoir une condition où aucun facteur de reprogrammation n’est exprimé. Par exemple, lors de l’utilisation de vecteurs porteurs de l’ADNc pour le facteur de reprogrammation et d’un rapporteur (par exemple, protéine fluorescente verte (GFP), DsRed), le contrôle négatif est représenté par le même vecteur portant uniquement le rapporteur. Lorsque l’on exprime plusieurs facteurs portant des rapporteurs différents, le contrôle négatif doit être ajusté en conséquence.
- Le lendemain du placage, inspectez les plaques à 24 puits pour vous assurer que les cellules ont adhéré aux lamelles.
- Sur la base de l’objectif expérimental et des ressources disponibles, l’expression forcée des facteurs de reprogrammation peut être réalisée par transduction virale (voir étape 2.3) ou transfection de l’ADN (voir étape 2.4).
REMARQUE : L’utilisation de rétrovirus ou de lentivirus nécessite l’approbation des autorités gouvernementales et doit être effectuée sous une enceinte de sécurité biologique au sein d’un laboratoire de niveau de sécurité 2 (SL2).
- Reprogrammer les astrocytes en transduisant les cellules avec le rétrovirus ou le lentivirus portant l’information génétique pour exprimer le(s) facteur(s) de reprogrammation d’intérêt comme décrit ci-dessous.
- Transduisez des cellules avec un titre viral élevé de 1 x 1010-1 x 1012 particules/mL en ajoutant 1 μL de suspension cellulaire directement dans le milieu astrocytaire. Cela garantit un taux d’infection élevé. Cultivez les cellules avec le milieu astrocytaire contenant des particules virales à 37 °C pendant 24 à 36 h avant de passer à la section 3, en fonction de l’objectif de l’expérience.
REMARQUE : Différents promoteurs peuvent être utilisés pour stimuler l’expression des transgènes (voir aussi Résultats représentatifs). Les promoteurs constitutifs (p. ex., cytomégalovirus (CMV), β-actine de poulet (CAG)} induisent l’expression du transgène plus tôt que les promoteurs inductibles ; Cependant, les deux types de promoteurs ont été utilisés avec succès pour reprogrammer les cellules en neurones.
- Les plasmides d’ADN peuvent également être introduits dans les astrocytes par transfection de l’ADN, comme décrit ci-dessous.
note: Cela peut être fait sous une enceinte de sécurité biologique approuvée pour SL1.
- Avant la transfection, procurez-vous le réactif de transfection, un ADN plasmidique des constructions souhaitées, un milieu astrocytaire frais et un milieu à teneur réduite en sérum (voir la table des matériaux). Calculez la quantité requise de milieu à sérum réduit (voir Tableau des matériaux) en considérant que chaque puits d’une plaque à 24 puits nécessite 300 μL de milieu à sérum réduit. Ajoutez la quantité appropriée de milieu à teneur réduite en sérum dans un tube de 50 ml et réchauffez-le à 37 °C.
- Lorsque le milieu à teneur réduite en sérum est chaud, aspirez le milieu astrocytaire de tous les puits et recueillez-le dans un tube de 50 ml. Filtrez le milieu astrocytaire collecté à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 μM pour éliminer les cellules détachées.
- Ajouter un volume égal de milieu astrocytaire frais au milieu filtré pour obtenir une solution suffisante pour ajouter 1 mL de milieu astrocytaire par puits. Maintenir le milieu conditionné aux astrocytes dans l’incubateur à 37 °C jusqu’à l’utilisation (étape 2.4.9).
note: Le milieu de culture est réutilisé car il contient plusieurs facteurs sécrétés qui soutiennent la viabilité de la culture.
- Ajoutez 300 μL de milieu préchauffé à teneur réduite en sérum dans chaque puits et remettez la plaque à 24 puits dans l’incubateur.
- Préparez la solution A, composée d’ADN et d’un milieu réduit en sérum. Pour chaque puits, utilisez un total de 0,6 μg d’ADN et ajoutez-le à 50 μL de milieu à sérum réduit. Conserver la solution A à température ambiante jusqu’à utilisation.
REMARQUE : En règle générale, un triplet technique par condition est pris en compte. Par conséquent, un mélange suffisant pour une réaction de 3,5 est préparé (par exemple, 2,1 μg d’ADN total dilué dans 175 μL de milieu réduit en sérum) pour assurer suffisamment de matériau pour transfecter trois puits d’une plaque de 24 puits.
- Préparez la solution B, composée du réactif de transfection et du milieu réduit au sérum. Pour chaque puits, ajoutez 0,75 μL de réactif de transfection à 50 μL de milieu à sérum réduit. Comme cette solution est commune à toutes les conditions de transfection, préparez-la en vrac pour réduire la variabilité entre les transfections.
- Incuber la solution B à température ambiante pendant 5 min. Ajouter la solution B à la solution A goutte à goutte dans un rapport de 1:1 et mélanger délicatement. Ne faites pas de vortex. Incuber la solution A+B pendant 20-30 min à température ambiante sous le capot.
- Répétez les étapes 2.4.5 à 2.4.7 pour toutes les conditions de transfection. Après 20-30 min, ajoutez la solution A+B dans chaque puits goutte à goutte pour un volume final de 100 μL. Agitez doucement la plaque et remettez les cellules dans l’incubateur à 37 °C pendant 4 h.
- Après 4 h, retirer le milieu de transfection et ajouter 1 mL du milieu conditionné aux astrocytes préchauffé préparé à l’étape 2.4.3. Maintenez les cellules pendant 36 à 48 h avant de passer à la section 3, selon le but de l’expérience.
3. Reprogrammation des astrocytes (analyse de 7 jours)
- Préparez le milieu de différenciation neuronale en ajoutant 1 ml de supplément de B27 à 49 ml de milieu de culture de base. Après 24 à 48 h, selon que les cellules ont été transduites ou transfectées (voir les étapes 2.3 et 2.4, respectivement), remplacer le milieu astrocytaire par 1 mL de milieu de différenciation neuronale par puits et les cellules de culture à 37 °C et 9 % de CO2,
REMARQUE : Les cellules peuvent également être maintenues à 5 % de CO2 si aucun incubateur à 9 % de CO2 n’est disponible. Cependant, la reprogrammation neuronale est plus efficace dans ces conditions.
- Facultatif : Pour augmenter l’efficacité de la reprogrammation, complétez le milieu de différenciation neuronale avec de la forskoline (concentration finale de 30 μM) et de la dorsofoxine (concentration finale de 1 μM) lors du remplacement du milieu astrocytaire par le milieu de différenciation. Lorsque vous choisissez de traiter des cellules avec de la forskoline et de la dorsomorphine, fournissez une deuxième dose de dorsomorphine 2 jours après le traitement initial. Ajoutez ce deuxième traitement directement dans le milieu de culture.
- La reprogrammation directe des astrocytes murins en cellules neuronales se produit normalement dans les 7 jours suivant le changement de milieu (Figure 1). Ainsi, 7 jours après le début de la reprogrammation neuronale, fixer ou collecter des cellules pour une analyse en aval.
