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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Ablation du cerveau avec racine nerveuse auditive intacte pour la stimulation
NOTE : Les souris pour ces expériences ont été obtenues en croisant des souris transgéniques ChAT-IRES-Cre sur un fond C57BL/6J avec des souris rapporteures tdTomato (Ai14). Les souris utilisées pour l’histologie et l’électrophysiologie présentaient un début post-auditif (P14-P23), qui est d’environ P12 chez les souris. Les neurones exprimant tdTomato dans le noyau ventral du corps trapézoïdal (VNTB) ont déjà été caractérisés comme des neurones olivocochlaires médians (MOC) dans cette lignée de souris.
- Euthanasier (p. ex. asphyxie au CO2) et décapiter l’animal en utilisant les procédures approuvées de l’établissement.
- À l’aide d’une lame de rasoir, coupez la peau sur la ligne médiane du crâne, du nez à l’arrière du cou. Pelez la peau pour exposer le crâne.
- À l’aide de petits ciseaux, faites une incision dans le crâne à travers la ligne médiane, en commençant par la base (extrémité caudale près de la moelle épinière) du crâne et en continuant vers le nez.
- Au niveau de la suture lambda, faites des incisions dans le crâne à partir de la ligne médiane, latéralement vers l’oreille des deux côtés. Retirez le crâne pour exposer le cerveau.
- En commençant par l’extrémité rostrale, soulevez doucement le cerveau du crâne avec une petite spatule de laboratoire ou une pince émoussée. Coupez le nerf optique et continuez à faire reculer doucement le cerveau, exposant la surface ventrale.
- Coupez les nerfs trijumeaux en les pinçant à l’aide d’une pince fine près de la surface ventrale du tronc cérébral.
note: Faites-le avec précaution, car le nerf vestibulocochléaire se trouve juste en dessous de celui-ci et doit être intact pour une éventuelle stimulation.
- Placez la préparation dans une boîte de Pétri en verre remplie d’une solution de tranchage à froid. Placez la parabole sous un microscope à dissection. Faites bouillir doucement avec du carbogène.
- Coupez le nerf facial près du tronc cérébral et exposez le nerf vestibulocochléaire.
- À l’aide d’une pince fine, enfoncez les pointes dans les foramens où le nerf vestibulocochléaire sort du crâne aussi loin que possible et pincez le nerf pour le sectionner, en laissant la racine nerveuse attachée au tronc cérébral. Répétez cette opération de l’autre côté.
- Une fois que les deux racines nerveuses sont libres, retirez les méninges et le système vasculaire de la surface ventrale du tronc cérébral près du corps trapézoïdal.
- Libérez complètement le cerveau du crâne en pinçant les nerfs crâniens et le tissu conjonctif restants, en prenant soin de préserver la moelle épinière restante si possible.
2. Bloquer et monter le cerveau sur scène (disque magnétique)
- Préparer la surface du cerveau à se fixer à la scène en bloquant le cerveau au niveau du chiasma optique.
- Avec la surface ventrale vers le haut, stabilisez le cerveau à l’aide d’un outil contondant pour immobiliser doucement la moelle épinière afin que le cerveau ne s’incline pas lors de l’étape suivante.
- Au niveau du chiasma optique, utilisez des pinces ouvertes pour créer le plan de blocage du cerveau en l’insérant à travers le cerveau jusqu’au fond de la parabole. Insérez la pince à un angle d’environ 20° par rapport à la verticale de sorte que les pointes sortent de la surface dorsale du cerveau caudal vers le chiasma optique.
- Coupez le long de la pince à l’aide de la lame de rasoir.
- Collez le cerveau à la surface de la scène.
- Préparez un petit bloc (~1 cm3) de gélose à 4 % pour soutenir le cerveau.
- Placez une petite goutte de colle sur la scène et étalez-la en un rectangle afin que le cerveau et le bloc d’agar puissent être collés.
- À l’aide d’une pince, soulevez délicatement le cerveau et tamponnez doucement l’excès de liquide à l’aide du bord d’une serviette en papier. Placez la surface bloquée sur la colle, la surface ventrale sera vers la lame lors du tranchage.
- Poussez doucement le bloc de gélose contre la surface dorsale du cerveau pour le soutenir pendant le tranchage et pour assurer un bon positionnement du cerveau (c’est-à-dire l’angle).
3. Trancher le cerveau pour créer une tranche de coin
REMARQUE : Préparez une tranche de cerveau à l’aide d’un vibratome qui a la racine nerveuse cochléaire du côté épais et les neurones olivocochléaires médiaux (MOC) et le noyau médial du corps trapézoïdal (MNTB) du côté mince.
- Placez le disque magnétique avec le cerveau attaché sur la base de la platine et placez-le dans la chambre de tranchage avec la surface ventrale du cerveau orientée vers la lame.
- Remplissez la chambre d’une solution de tranchage glacée et faites bouillir du carbogène.
- Abaissez la lame dans la solution et coupez les tranches caudales dans la région d’intérêt pour vous assurer que les tranches sont symétriques. Si les tranches semblent asymétriques, inclinez légèrement la platine pour obtenir une symétrie.
note: Des vitesses de lame comprises entre 0,05 et 0,10 mm/s étaient efficaces pour couper des tranches saines et peuvent varier en fonction de l’âge de l’animal et de la région du cerveau.
- Une fois que les tranches sont symétriques, décalez la platine de ~15° (correspondant à environ 3 anneaux concentriques sur la base de la platine) d’un côté.
note: Éloignez la platine de la racine nerveuse auditive que vous souhaitez conserver dans la tranche.
- Continuez à trancher soigneusement jusqu’à ce que la racine du nerf auditif soit proche de la surface d’un côté et que le nerf facial soit visible à la surface de l’autre côté.
- Reculez la platine de 15° par rapport à la position d’origine.
- Éloignez la lame du tissu et faites pivoter la base de la platine à 90° de sorte que le bord latéral du côté mince soit face à la lame. Abaissez la lame de plusieurs centaines de microns, puis rapprochez lentement la lame du bord du tissu. Répétez cette opération jusqu’à ce que la lame touche le bord latéral. Abaissez la lame à l’épaisseur souhaitée du bord fin de la tranche, ici deux cents microns supplémentaires.
note: La tranche résultante a idéalement une épaisseur de ~300 mm au niveau du noyau ventral du corps trapézoïdal (VNTB) du côté où le serrage du patch aura lieu.
- Éloignez la lame du tissu et faites pivoter la base de la platine vers l’arrière de manière à ce que la surface ventrale lui fasse face.
- Faites la coupe qui désigne la surface rostrale de la tranche de quartier. Transférez la tranche sur un morceau de papier d’interface (1 cm2), surface caudale vers le bas. Déplacer la tranche dans la chambre d’incubation ou dans un autre appareil d’incubation approprié pour la récupération (30 min à 35 °C).
note: Le nerf facial doit être visible sur les deux hémisphères de la tranche sur la surface rostrale (voir Figure 1B).
