Stimulation de la différenciation cellulaire neuronale à l’aide de nanotiges d’or

Résumé

Source : Paviolo., et al. Stimulation optique des cellules neuronales assistée par nanotiges. J. Vis. Exp. (2015).

Cette vidéo présente une technique pour favoriser la différenciation neuronale en exposant les cellules nerveuses à des nanotiges d’or et à la lumière laser, qui forme des projections cellulaires soutenues par la tubuline βIII. La coloration et l'observation de la tubuline et du noyau cellulaire par microscopie à épifluorescence révèlent les excroissances cellulaires, indiquant l'efficacité des nanobâtonnets dans la différenciation neuronale.

Protocole

1. NG108-15 Culture et différenciation de lignées cellulaires neuronales

1. Pour le milieu de culture cellulaire, préparer 500 ml de milieu stérile Dulbecco's modified Eagle (DMEM) contenant 10 % (p/v) de sérum de veau fœtal (FCS), 1 % (p/v) de L-glutamine, 1 % (p/v) de pénicilline/streptomycine et 0,5 % (p/v) d'amphotéricine B.
   Remarque : Les suppléments peuvent être aliquotes, stockés à -20 °C et ajoutés au support le jour requis. Le milieu de culture cellulaire peut être réfrigéré dans un état stérile pendant 1 mois maximum.
2. Pour le milieu de différenciation cellulaire, préparer 50 ml de DMEM stérile contenant 1 % (p/v) de L-glutamine, 1 % (p/v) de pénicilline/streptomycine et 0,5 % (p/v) d’amphotéricine B.
3. Cultivez des cellules neuronales NG108-15 dans 10 ml de milieu de culture cellulaire dans des flacons T75 en polystyrène dans un incubateur sous atmosphère humidifiée (5 % de CO2 à 37 °C). Normalement, ensemencez 1,5-2 × 10⁵ cellules dans chaque flacon pour être prêt en 3-4 jours. Changez le milieu de culture cellulaire tous les deux jours.
   Remarque : Pour éviter les dérives ou les variations génétiques, n’utilisez pas de cellules plus anciennes que le passage 21 pour les expériences.
4. Lorsque 70 à 80 % de culture est confluente, remplacez le milieu par un milieu de culture cellulaire frais et chaud. Détachez mécaniquement les cellules en frappant doucement le fond de la fiole confluente. N’utilisez pas de trypsine.
5. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 600 x g et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 2 ml de milieu de différenciation cellulaire chaud.
6. Graine 2 × 10⁴ cellules/cm² dans une plaque de polystyrène 96 puits de culture tissulaire avec 200 μl de milieu de différenciation cellulaire. Incuber l’expérience pendant 1 jour à 5 % de CO2 / 37 °C.
7. Ajouter entre 3,2 × 10,⁹ et 4,2 × 10¹⁰ particules/ml de solution de nanotige d’or (Au NR) le jour 2 et l’incuber pendant 24 heures supplémentaires. N’ajoutez pas les particules pour les expériences de contrôle.
   Remarque : Comme contrôle alternatif, des nanoparticules d’or (NP Au) avec une longueur d’onde d’absorption maximale bien différenciée peuvent être utilisées à des fins de comparaison, Pour un comportement cellulaire plus cohérent, maintenez la densité cellulaire constante et ne modifiez pas la surface du puits avant l’ensemencement cellulaire.

2. Amélioration de l’excroissance de Neurite

1. Couplez le laser avec une fibre optique monomode (ouverture numérique = 0,13) et terminez-le avec un connecteur de fibre (les connecteurs FC sont pratiques et couramment disponibles). Mesurez la puissance laser de sortie à l’aide d’un wattmètre standard. Pour obtenir les résultats les plus efficaces, faites correspondre la longueur d’onde maximale du laser au pic de résonance plasmonique des NR.
2. Le jour 3 suivant l’incubation du NR, fixez le connecteur FC au puits. Irradiez des échantillons et des contrôles à RT pendant 1 min en onde continue pour différentes puissances laser. Laissez la culture se poursuivre pendant 3 jours supplémentaires à 5 % de CO2 / 37 °C. Répétez l’irradiation laser pour un minimum de 3 mesures indépendantes.
   Remarque : Différents temps d’irradiation et fréquences d’impulsion peuvent être sélectionnés en fonction de l’application.
3. Caractériser le laser en termes de diamètre de faisceau et d’irradiance laser (W∙cm-2).
   1. Pour une fibre monomode standard, utilisez NA = n∙sinθ, où n est l’indice de réfraction du milieu utilisé et θ est le demi-angle du cône de lumière sortant de la fibre (voir Figure 1A). D’après la trigonométrie, r = tanθ∙d, où r est le rayon du faisceau et d est la distance entre la fibre et l’échantillon. Le connecteur FC s’adapte au diamètre du puits, éclairant ainsi l’échantillon à une distance d = 2,70 ± 0,20 mm. La lumière sort de la fibre dans l’eau (n = 1,33), ce qui donne r = tan(sin-1(NA/n))∙d.
   2. À l’aide de cette dernière équation, calculez le rayon du faisceau laser, l’aire du faisceau correspondante et l’irradiance laser moyenne (puissance laser divisée par l’aire du faisceau) sur la cible (voir l’exemple de graphique de la figure 1B). Ces valeurs représentent l’irradiance moyenne sur la zone éclairée.
   3. Évaluez les erreurs pour les mesures avec la théorie générale de la propagation des erreurs.
      Remarque : La distance entre le connecteur FC et l’échantillon peut être mesurée à l’aide de photographies de l’agencement expérimental et du post-traitement de l’image à l’aide d’un logiciel approprié (par exemple ImageJ).
4. Au jour 5, retirer le milieu de différenciation cellulaire des expériences et fixer les échantillons avec une solution de formaldéhyde à 3,7 % (v/v) pendant 10 min, puis perméabiliser les cellules avec 0,1 % (v/v) de Triton X-100 pendant 20 min.
5. Ajouter 3 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) aux échantillons pendant 60 minutes pour bloquer les sites de liaison aux protéines qui n’ont pas réagi. Étiqueter les échantillons pour l’anti-βIII-tubuline pendant la nuit (5 μg/ml dans du PBS complété par 1 % de BSA) à 4 °C.
6. Incuber les cellules pendant 90 minutes dans l’obscurité avec un anticorps secondaire approprié (par exemple, anticorps anti-IgG de souris conjugué à la TRITC (tétraméthylrhodamine)) en utilisant une concentration de 0,4 à 2 μg/ml dans 1 % de BSA dans du PBS. Marquer les noyaux cellulaires avec du DAPI (4′,6-diamidino-2-phénylindole) (0,1 μg/ml dans de l’eau désionisée) pendant 10 min
   Remarque : La conjugaison et la concentration des anticorps peuvent varier selon le protocole de l’entreprise. Laver les échantillons avec du PBS deux fois pendant 5 minutes après chaque étape de coloration.
7. Imagez des échantillons par épifluorescence ou microscopie confocale avec un objectif d’au moins 20×. Choisissez les filtres du microscope en fonction de l’anticorps secondaire. Sélectionnez un filtre DAPI (λEX = 358 nm ; λEM = 488 nm) pour visualiser les noyaux cellulaires.
8. Analysez les images en évaluant : i) la longueur maximale des neurites (notez la longueur de l’extrémité du neurite au début du corps cellulaire), ii) le nombre de neurites par cellule neuronale (additionnez tous les neurites par cellule) et iii) le pourcentage de cellules avec des neurites (divisez le nombre total de cellules exprimant la βIII-tubuline par le nombre total de cellules avec un noyau coloré positivement)

Résultats

Graphique 1. Le dispositif expérimental de fibre optique (A) et les irradiances laser moyennes en fonction de la puissance laser pour un faisceau laser de surface sont égales à 0,4 mm2 (B). Les paramètres du faisceau sont (A) : le demi-angle du cône de lumière maximal sortant de la fibre (θ), le rayon du faisceau (r) et la distance entre la fibre optique et l’échantillon (d).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Au NR	Sigma Aldrich	716812
NG108-15	Sigma Aldrich	8811230
DMEM	Sigma Aldrich	D6546
Fcs	Technologies de la vie	10100147
L-glutamine	Sigma Aldrich	Référence G7513
Pénicilline/streptomycine	Technologies de la vie	15140122
Amphotéricine B	Technologies de la vie	15290018
Formaldéhyde	Sigma Aldrich	Réf. F8775
Triton X-100	BDH	Réf. T8532
Bsa	Sigma Aldrich	A2058
Anti-βIII-tubuline	Promega	Réf. G7121
Anticorps IgG anti-souris conjugué à TRITC	Sigma Aldrich	Réf. T5393
DAPI	Invitrogen	D1306
Spectromètre UV-Vis	Systèmes médicaux Varian Inc.	Cary 50 Biographie
Mini centrifugeuse	Eppendorf	Mini tour
Bain sonique	Unisonics Australie	FPX 10D
Incubateur de culture cellulaire	Kendro	Cellule Hera 150
Centrifugeuse de culture cellulaire	Hettich	Rotofix 32A
Diode laser	Optotech	Fibre monomode 780 nm couplée LD
fibre optique	Thorlabs	780 ch
Capteur de puissance	cohérent	Vérification laser
ImageJ	http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
Microscope épifluorescent	Axon Instruments	ImageX-press 5000A
Pbs
Plaque de polystyrène 96 puits
Le CO2
Flacons T75