1. Préparation des solutions
- Média E2 (1x)
- Préparez 100 solutions E2A (500 ml), 500 solutions E2B (100 ml) et 500 solutions E2C (100 ml) en combinant tous les composants indiqués dans le tableau 1. Solutions d’autoclave E2A, E2B et E2C. Conserver à 4 °C.
- Pour 1 support E2 : Combinez 5 ml de 100 E2A, 1 ml de 500 E2B et 1 ml de 500 E2C. Porter le volume à 500 mL avec de l’eau stérile. Ajustez le pH à 7,0-7,5.
- Préparez 50 mL d’aliquotes de 1 milieu E2 et conservez-les à -20 °C pour un stockage à long terme. Cependant, des précipitations peuvent se produire lors de la décongélation. Assurez-vous que les précipitations sont complètement dissoutes avant d’utiliser la solution mère.
Tableau 1 : Composants de 1x milieu E2 pour la culture cellulaire de poisson-zèbre.
| solution | composant | quantité | concentration |
| 100X E2A (500 ml) | | | |
| NaCl | 43,8 grammes | 1500 mM |
| Kcl | 1,88 g | 50 millions d’euros |
| MgSO4 | 6 grammes | 100 millions d’euros |
| KH2PO4 | 1,03 gramme | 15 millions de livres |
| Na2HPO4 | 0,34 g | 5 millions d’euros |
| 500X E2B (100 ml) | | | |
| CaCl2 | 5,5 grammes | 500 mM |
| 500X E2C (100 ml) | | | |
| NaHCO3 | 3 grammes | 350 millions d’euros |
| 1X E2 (500 ml) | | | |
| 100X E2A | 5 mL | 1 fois |
| 500X E2B | 1 mL | 1 fois |
| 500X E2C | 1 mL | 1 fois |
- Médias E3 (1x)
- Dissoudre les composants dans 1 L d’eau stérile comme indiqué dans le tableau 2 pour obtenir 100 fois le stock. Diluez le bouillon dans de l’eau stérile pour obtenir 1 milieu E3.
- Ajouter 0,2 % de bleu de méthylène. Pour 20 ml de milieu 1x E3, ajoutez 40 μL de bleu de méthylène.
Tableau 2 : Composants de 100x milieux E3 pour la conservation des embryons de poisson-zèbre.
| composant | Montant (g) | Concentration dans le stock 100X (mM) |
| NaCl | 29.22 | 500 |
| Kcl | 1,26 | 17 |
| CaCl2 2H2O | 4,85 | 33 |
| MgSO4 7H2O | 8.13 | 33 |
- 80x solution mère saline
- Combinez tous les composants indiqués dans le tableau 3. Ajouter de l’eau pour faire 100 mL de solution. Mélanger jusqu’à ce que tous les composants soient dissous. Conserver la solution à 4 °C.
Tableau 3 : Composants d’une solution saline 80x pour les milieux de culture cellulaire de poisson zèbre.
| composant | Montant (g) | Concentration en stock (mM) |
| glucose | 1,44 | 80 |
| Pyruvate de sodium | 0,44 | 40 |
| CaCl2 2H2O | 0,148 | 10 |
| HEPES | 6.1 | 256 |
- Milieu de culture cellulaire de poisson-zèbre (ZFCM+)
- Combinez tous les composants indiqués au tableau 4 pour obtenir un support de 250 ml. Ajustez le pH à 7,5. Filtrer le média à l’aide d’un filtre de 0,22 μm et le stocker à 4 °C.
Tableau 4 : Composants du milieu de culture cellulaire de poisson-zèbre avec sérum et antibiotiques.
| composant | Quantité (mL) | % du volume |
| Milieu L-15 (avec rouge de phénol) | 212,75 | 85,1 |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | 5 | deux |
| Pénicilline/streptomycine | 1 | 0,4 |
| Solution saline 80X | 3,125 | 1,25 |
| Eau | 28.125 | 11 h 25 |
2. Culture de cellules ganglionnaires rétiniennes primaires dérivées d’embryons de poisson-zèbre
REMARQUE : Effectuez les étapes 2.1 et 2.2 dans une hotte à flux laminaire.
- Préparation des lamelles
- Préparez 4 à 6 plaques de culture dans chaque expérience. Utilisez des lamelles nettoyées à l’acide (22 x 22 mm carrés ; 0,16 à 0,19 mm d’épaisseur) qui sont stockées dans de l’éthanol à 100 %.
- Retirez une lamelle du récipient de stockage à l’aide d’une pince et brûlez-la pour éliminer l’éthanol résiduel.
- Séchez complètement la lamelle à l’air libre en la plaçant en biais à l’intérieur d’une boîte de culture de 35 mm.
- Préparez la solution de travail de poly-D-lysine (PDL) (1x) en diluant 10x stock (5 mg/mL) dans de l’eau stérile.
- Appliquez 100 μL de LDP à 0,5 mg/mL au centre de chaque lamelle et évitez d’étaler la solution sur les bords.
- Incuber le PDL sur des lamelles pendant 20 à 30 min à température ambiante (RT). Assurez-vous que le PDL ne se dessèche pas.
- Lavez trois fois la LDO avec 0,5 mL d’eau stérile. Laissez les assiettes sécher complètement.
- Préparez la solution de travail de la laminine (1x) en diluant 50x stock (1 mg/mL) dans 1x PBS.
- Appliquez 100 μL de laminine à 20 μg/mL dans du PBS au centre de chaque lamelle et évitez de répandre la solution sur les bords.
- Incuber les plaques à 37 °C dans un incubateur humidifié pendant 2 à 6 h. Éviter le séchage de la solution de laminine.
- Dissection embryonnaire et placage des CGR
- Préparez et étiquetez quatre boîtes de culture tissulaire de 35 mm et remplissez-les de 4 ml d’éthanol à 70 %, « E2 milieu 1 », « E2 milieu 2 », « milieu E2 3 » le jour de la dissection. Conservez la vaisselle au réfrigérateur jusqu’à dissection.
- Lorsque les embryons de poisson-zèbre sont 34 heures après la fécondation (hpf), sortez les boîtes de culture recouvertes de laminine de l’incubateur et lavez les lamelles trois fois avec 0,5 mL de 1x PBS.
- Après le lavage final, ajoutez 4 mL de milieu ZFCM(+) dans chaque plat de culture et évitez de sécher la plaque.
- Récupérez les plats de culture préparés à l’étape 2.2.1. Qu’ils s’équilibrent en RT.
- Remplissez 4 à 6 tubes PCR avec 15 μL de milieu ZFCM(+). Un tube est nécessaire pour préparer les CGR à partir de 4 yeux à plaquer sur une lamelle.
- Récupérez les embryons de poisson-zèbre de l’incubateur et immergez-les dans une boîte de culture tissulaire de 35 mm contenant 70 % d’éthanol pendant 5 à 10 secondes pour les stériliser.
- À l’aide d’une pipette de transfert, transférez les embryons dans le milieu E2 1 plat contenant du milieu E2 stérile pour laver l’excès d’éthanol.
- Transférez les embryons dans la boîte E2 Media 2 et retirez leurs chorions avec des pinces tranchantes.
- Transférez les embryons dans la boîte finale E2 Media 3 pour effectuer des dissections.
- À l’aide d’une paire de pinces fines, disséquez les rétines.
- Positionnez et tenez les embryons en avant de leur jaune avec l’une des pinces et retirez la queue en arrière du sac vitellin avec l’autre pince.
- Saisissez le cou avec une pince et retirez la tête pour exposer le cerveau et les yeux au média E2. Évitez de couper le sac vitellin.
- Avec la pointe d’une pince fine, roulez doucement les yeux de la tête, tout en maintenant le tissu crânien vers le bas avec la deuxième pince. Gardez les yeux isolés des débris de tissus adjacents.
- Transférez quatre yeux dans l’un des tubes préalablement préparés contenant du ZFCM(+).
- Titrez doucement de haut en bas avec la pipette P20 et une pointe jaune environ 45 fois pour dissocier les cellules. Évitez les bulles d’air.
- Transférez le ZFCM(+) avec les cellules dissociées au centre de la lamelle. Répétez les étapes 10 à 12 pour les lamelles supplémentaires.
- Maintenir les cultures sur une paillasse à 22 °C sur un support en mousse de polystyrène pour absorber les vibrations.
- Effectuez l’imagerie 6 à 24 h après le placage.
