1. Absorption des nanoparticules magnétiques cellulaires (MNP)
- Préparez le milieu de croissance de base pour la culture cellulaire PC12 en ajoutant 10 % de sérum de cheval (HS), 5 % de sérum de veau fœtal (FBS), 1 % de L-glutamine, 1 % de pénicilline/streptomycine et 0,2 % d’amphotéricine dans le milieu du Roswell Park Medical Institute (RPMI), et filtrez à l’aide d’un filtre en nylon de 0,22 μm.
- Ajouter 1 % de sérum de cheval (HS), 1 % de L-glutamine, 1 % de pénicilline/streptomycine et 0,2 % d’amphotéricine dans un milieu RPMI pour préparer le milieu de différenciation PC12 et filtrer à l’aide d’un filtre en nylon de 0,22 μm.
- Cultivez des cellules dans une fiole de culture non traitée avec 10 mL de milieu de croissance basique ; ajoutez 10 mL de milieu de culture basique dans la fiole tous les 2 ou 3 jours, puis sous-cultivez les cellules après 8 jours.
- Pour l’absorption cellulaire, centrifuger la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger pendant 8 min à 200 × g et à température ambiante, puis jeter le surnageant.
- Remettre les cellules en suspension dans 3 mL de milieu de croissance basique frais. Encore une fois, centrifugez la suspension cellulaire pendant 5 minutes à 200 × g et à température ambiante, puis jetez le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans 3 mL de milieu de différenciation frais.
- Aspirez les cellules 10 fois à l’aide d’une seringue et d’une aiguille pour briser les amas de cellules. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ensemencez 10à 6 cellules dans une boîte régulière non enrobée de 35 mm.
- Ajoutez dans le plat le volume calculé de suspension de MNP et le volume de milieu de différenciation pour obtenir la concentration de MNP et le volume total souhaités. Mélanger les cellules, les MNP et le milieu de différenciation ; incuber le plat dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 à 37 °C pendant 24 h.
- Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 200 × g à température ambiante et jeter le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu de différenciation frais et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
2. Différenciation et croissance cellulaires sur plateforme magnétique
- Nettoyez le substrat à motifs avec de l’éthanol à 70 % v/v/ et placez le substrat dans une boîte de culture de 35 mm dans la hotte. Placez un grand aimant (~1500 Oersted) sous le substrat à motifs pendant 1 min et retirez l’aimant en déplaçant d’abord le plat vers le haut et loin de l’aimant, puis retirez l’aimant de la hotte. Allumez la lumière ultraviolette pendant 15 min.
- Enduisez le substrat de collagène de type 1 en diluant le collagène de type 1 (solution de queue de rat) 1:50 dans de l’éthanol à 30 % v/v. Pour enrober un plat de 35 mm, ajoutez 20 μL de collagène à 1 ml d’éthanol à 30 %.
- Couvrez le plat avec la solution et attendez que toute la solution s’évapore, laissant le plat à découvert pendant quelques heures. Laver 3x dans stérile 1x PBS ; La lame de verre est prête pour l’ensemencement cellulaire.
- Mettez les cellules en suspension après l’absorption cellulaire des MNP, ensemencez 10 cellulesde 5 cellules dans une boîte de culture de 35 mm et ajoutez 2 ml de milieu de différenciation. Incuber la culture dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 à 37 °C.
- Après 24 h, ajouter 1:100 de β-NGF murin frais (concentration finale de 50 ng/mL). Renouveler le milieu de différenciation et ajouter du β-NGF murin frais tous les 2 jours.
