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1. Préparation de plaques recouvertes d’une matrice de membrane basale qualifiées pour des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh)
- Décongeler lentement la solution de matrice de membrane basale qualifiée hESC (voir le tableau des matériaux) à 4 °C pendant au moins 2 à 3 h ou toute la nuit pour éviter la formation d’un gel.
- Pour préparer des plaques revêtues d'une matrice de membrane basale, diluez la matrice dans du milieu Eagle modifié Dulbecco froid avec F12 (DMEM + F12) jusqu'à une concentration finale de 2 %. Bien mélanger et enduire chaque puits d’une plaque à 6 puits avec 1 mL de la solution matricielle diluée.
- Incuber les plaques revêtues d’une matrice de membrane basale à température ambiante (RT) pendant au moins 3 h ou à 4 °C pendant la nuit.
note: Les plaques avec matrice de membrane basale peuvent être stockées à 4 °C pendant 1 semaine avant que la solution matricielle ne soit retirée et que les plaques ne soient utilisées.
2. Adaptation des CSEh de type colonie à la culture de CSEh sur cellule unique
- Pour passer les cultures exemptes de nourriture de type H9 (WA09), les CSEh cultivées sur la matrice de la membrane basale, aspirent le milieu des puits (figure 1A).
- Laver 1 fois avec 1 ml de DPBS. Ajouter 1 mL de solution de dispase (1 U/mL) par puits et incuber à 37 °C pendant 20 min.
- Retirez la dispase, lavez les cellules 1x doucement avec 2 ml de DMEM/F12, retirez le milieu et ajoutez 2 ml de DMEM/F12 dans chaque plaque.
- Détachez doucement les colonies en les pipetant doucement de haut en bas et transférez-les dans un tube de 15 ml.
- Centrifuger les granulés pendant 2 min à 370 x g et aspirer le fluide.
- Pour dissocier les pastilles cellulaires en cellules individuelles, ajouter 2 mL de solution de décollement cellulaire (concentration 1x, voir tableau des matières) et incuber à 37 °C pendant 10 min.
- Centrifuger les cellules pendant 2 min à 370 x g et retirer la solution de détachement.
- Ajoutez du milieu ESC humain mTeSR1 frais et dissociez les cellules en cellules uniques en pipetant doucement de haut en bas.
- Pour adapter les CSEh de type colonie à une culture de type unicellulaire, plaquez environ 1,5 à 2,0 x 106 CSEh dans chaque puits de la membrane basale recouverte d’une matrice à 6 puits dans 2 mL de mTeSR1 contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK pendant 24 h (figure 1A).
- Après 24 h, remplacez le milieu hESC par mTeSR1 frais sans inhibiteur de ROCK et laissez les hESC se développer comme un type unicellulaire pendant 3 jours. Changez de support tous les jours.
- Le jour 4, lorsque les cultures atteignent près de 100 % de confluence, dissocier les cellules dans la solution de détachement, puis replaquer comme décrit à l’étape 2.6.
note: L’inhibiteur de ROCK améliore la survie cellulaire au cours des 24 premières heures de culture de CSEh de type unicellulaire.
3. Différenciation des CSEh de type unicellulaire en NPC (Figure 2)
- Pour induire la différenciation des NPC, dissocier les CSEh de type unicellulaire avec 1 mL de solution de détachement (1x) et incuber pendant 10 min à 37 °C.
- Centrifuger les cellules pendant 2 min à 370 x g et retirer le surnageant de la solution de détachement. Ajouter 1 mL de DMEM/F12 et remettre les cellules en suspension par pipetage doux.
- Cellules sur plaque sur une plaque à 6 puits revêtue d’une matrice de membrane basale à une densité de 2 x 105 cellules/puits dans 2 mL de mTeSR1 contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK.
- Après 24 h, remplacer le milieu de culture par un milieu d’induction neurale (DMEM avec 1 % de B27 moins vitamine A) complété par 1 μM de dorsomorphine et 5 μM de SB431542.
- Changez de milieu tous les deux jours pendant les 4 premiers jours de l’induction neurale, puis tous les jours jusqu’à ce que vous atteigniez la confluence au jour 7 (Figure 2B).
REMARQUE : (1) La dorsomorphine inhibe la voie BMP en ciblant les récepteurs ALK2,3,6 et inhibe également l’AMPK ; SB431542 est un inhibiteur de la voie TGFβ/Activin en ciblant ALK5,7. (2) Le même protocole a été testé avec une autre ligne ESC (WA01), qui a donné des résultats similaires à ceux de WA09. (3) Nous avons généralement utilisé Matrigel pour la matrice de la membrane basale ; cependant, les cellules peuvent être cultivées sur Geltrex puis différenciées en NPC avec des résultats très similaires comme l’indique l’expression de plusieurs marqueurs NPC (Figure 3D, E). Manipulez Geltrex de la même manière que Matrigel (voir rubrique 1).
