Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Stérilisation des matériaux
REMARQUE : Tout le matériel et les solutions doivent être stérilisés avant utilisation.
- Stérilisez tous les outils chirurgicaux et le matériel de tranchage du vibratome (porte-couteau, disque d’échantillon, plateau tampon) dans un four de stérilisation à sec pendant 4 h à 180 °C.
- Stérilisez le matériel ou l’équipement sensible à la température par irradiation UV ou gamma.
- Stériliser les milieux et les solutions par autoclave ou filtration à travers des membranes poreuses de 0,22 μm.
2. Préparation des solutions
- Préparez 15 à 20 mL de solution de transport : 50 % v/v de solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) pH 7,4, milieu basal à 50 % v/v pour le maintien des neurones cérébraux postnatals et adultes (table des matières), complété par 10 mM d'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinésulfonique (HEPES), 3 mg/mL de glucose et 33 μg/mL de gentamicine.
note: La solution de transport doit être réfrigérée et oxygénée (bouillonnante de gaz carbogie) pendant au moins 20 minutes avant le prélèvement de l’échantillon.
- Préparez 300 ml de solution de tranchage (HBSS complété par 10 mM d’HEPES et 3 mg/mL de glucose) et refroidissez-le dans un congélateur jusqu’à la formation initiale des cristaux.
- Préparez 20 mL de milieu de culture : milieu de base pour l’entretien des neurones cérébraux postnatals et adultes (Table des matières) complété par un dérivé de L-glutamine à 1 % (Table des matières), un supplément à 2 % pour la culture neuronale (Table des matières), 1 % de pénicilline/streptomycine et 0,25 g/mL d’amphotéricine B.
3. Configuration de l’appareil de tranchage
REMARQUE : Ce protocole est idéalement réalisé avec l’aide d’un collègue en raison de la logistique de la collecte des échantillons dans la salle d’opération.
- Dans un seau de glace salée ajoutée, laisser reposer la solution de tranchage sous le bouillonnement du mélange de carbogène (95 % O2, 5 % CO2) pendant au moins 20 min avant utilisation
- Préparez un bloc d’agarose à 3 % (environ 2 cm x 2 cm x 2 cm) et collez-le sur le disque de l’échantillon de vibratome afin de créer un support mécanique supplémentaire à l’échantillon de tissu pendant le tranchage (figure 1E).
- Réglez le vibratome pour le tranchage : épaisseur de section de 200 μm, fréquence de vibration de 100 Hz et vitesse de tranchage entre 0,5 et 1,0 mm/s.
- Verrouillez le plateau de tampon du vibratome sur la base du vibratome et ajoutez de la glace pour le maintenir au réfrigérateur avant de recevoir la solution de tranchage et l’échantillon, et tout au long de la procédure de tranchage.
4. Prélèvement d’échantillons
REMARQUE : Dans ce protocole, des tissus néocorticaux humains ont été prélevés dans la salle d’opération et transportés au laboratoire.
ATTENTION : Lorsque vous manipulez des échantillons humains, suivez les protocoles de sécurité appropriés établis par l’établissement.
- Mettre en place l’appareil de transport (figure 1C) qui se compose : d’une bouteille de gaz portable avec un mélange de carbogène reliée à une soupape de pression/flux qui commande la sortie de gaz reliée à un tube en silicium qui relie la sortie de gaz à la cuve de transport ; une cuve de transport, généralement un tube de centrifugeuse conique de 50 mL avec couvercle perforé pour l’entrée de gaz, contenant la solution de transport ; et de la glace pour le refroidissement des échantillons pendant le transport.
- Prélever et transporter l’échantillon (figure 1B) immédiatement au laboratoire. Immerger l’échantillon dans une solution de transport à froid (constamment bouillonnée avec un mélange de carbogène).
5. Découpage
- Transvasez l’échantillon dans une boîte de Pétri (100 mm x 20 mm) contenant une solution de tranchage et, à l’aide d’outils chirurgicaux fins, retirez avec précaution la plus grande quantité possible de méninges restantes dans l’échantillon (figure 1D).
- Choisissez la meilleure orientation de l’échantillon pour produire des tranches avec les caractéristiques particulières du plan d’expérience, et avec une lame de scalpel n° 24, coupez une surface plane pour être la base collée au disque de l’échantillon.
- À l’aide d’une cuillère en plastique jetable et de pinceaux délicats, récupérez le fragment de la boîte de Pétri et séchez l’excédent de solution à l’aide de papier filtre (séchez par capillarité et évitez de toucher le fragment de tissu avec du papier).
- À l’aide de superglue, fixez le tissu au disque de l’échantillon de vibratome jusqu’à ce qu’il adhère fermement au disque et soit en contact avec le bloc d’agarose (figure 1E).
- Placez le disque de l’échantillon du vibratome (avec le tissu correctement attaché) dans le plateau tampon du vibratome rempli de solution de tranchage qui doit bouillonner pendant tout le processus.
- Verrouillez le porte-couteau en place avec la lame de rasoir fermement fixée.
- La solution de tranchage doit couvrir à la fois l’échantillon et la lame, puis commencer à trancher (Figure 1F).
- Coupez l’échantillon en tranches de 200 μm.
note: Bien que certains vibratomes coupent les éprouvettes automatiquement, l’observation attentive et les ajustements mineurs de la vitesse de tranchage au cours du processus peuvent aider à produire de meilleures tranches. Jeter les tranches irrégulières initiales.
- Transférez les tranches du plateau tampon dans une boîte de Pétri avec une solution de tranchage et coupez les bords lâches et l’excès de matière blanche dans une proportion d’environ 70 % de cortex / 30 % de matière blanche.
6. La culture
REMARQUE : Effectuez cette étape dans une armoire à flux laminaire sous un environnement stérile.
- Ajouter 600 μL de milieu de culture par puits (dans une plaque à 24 puits) et incuber pendant au moins 20 min à 36 °C et 5 % de CO2 avant de plaquer les tranches.
- Dresser une tranche par puits à l’aide d’un pinceau (figure 1G).
- S’il y a des puits inutilisés dans la plaque, remplissez-les de 400 μL d’eau stérile.
- Incuber la plaque à 36 °C, 5 % CO2.
note: Le premier remplacement du milieu doit être effectué entre 8 et 16 h après le placage en fonction de la taille de la tranche.
- Compléter 10 mL du milieu de culture préalablement préparé avec 50 ng/mL de facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF).
note: Au cours des 8 à 16 premières heures, les tranches sont incubées dans 600 μL de milieu pour éviter la privation de nutriments et l’acidification, car la consommation de milieu dans cette phase est accélérée. À partir de l’étape suivante, le volume de fluide par puits est ajusté à 400 μL.
- Retirer 333 μL du milieu conditionné de chaque puits et ajouter 133 μL de milieu frais supplémenté en BDNF.
- Répétez le processus de remplacement du milieu toutes les 24 h en remplaçant un tiers du milieu conditionné par un milieu frais supplémenté en BDNF.
