Isolement et culture de la microglie à partir de cerveaux de rats à l’aide de milieux sans sérum

Résumé

Source : Collins, H. Y., et al., Isolation et culture de la microglie de rongeurs pour promouvoir une morphologie ramifiée dynamique dans un milieu sans sérum. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo présente une méthode d’isolement et de culture de microglie à partir de cerveaux de rats. Il s’agit de séparer la microglie d’autres cellules neuronales et non neuronales à l’aide de plaques recouvertes d’un anticorps monoclonal spécifique de la microglie.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Préparation d’une boîte de Pétri pour l’immunopannage CD11b (Jour 0)

REMARQUE : Préparez 1 boîte d’immunopanning pour 1 à 2 cerveaux de rats juvéniles.

1. Ajouter 25 mL de solution de Tris pH 9,5 à 50 mM dans une boîte de Pétri de 15 cm.
2. Ajouter des IgG anti-souris de chèvre (chaînes H+L) dans la boîte pour une concentration finale de 6 μg/mL. Agitez la plaque pour répartir uniformément.
3. Incuber le plat pendant 1 à 3 h à 37 °C.
4. Rincer la vaisselle trois fois avec du DPBS++ (solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec Ca²⁺ et Mg²⁺), puis remplacer par une solution de tampon de cuisson contenant 1 μg/mL d’anticorps OX42. Laissez la vaisselle toute la nuit à température ambiante sur une surface plane.

2. Prélèvement de tissus (Jour 1)

REMARQUE : Ce protocole devrait prendre ~3 à 4 h.

1. Avant de commencer, assurez-vous que toutes les solutions sont stériles et réfrigérées sur de la glace. Réfrigérez tous les instruments sur de la glace et stérilisez-les à l’éthanol avant de les utiliser.
2. En suivant les procédures réglementaires appropriées, sacrifiez un rat de laboratoire juvénile par asphyxie au dioxyde de carbone.
   note: Alternativement, les animaux plus jeunes peuvent être sacrifiés avec une dose létale de kétamine/xylazine (100 à 200 μL de kétamine à 24 mg/mL, 2,4 mg/mL de xylazine). La kétamine/xylazine doit être utilisée si les animaux sont âgés de moins de 14 jours. Si vous utilisez plusieurs animaux, extrayez le tissu d’un animal et placez-le dans du DPBS⁺⁺ pré-réfrigéré sur de la glace avant de passer aux animaux suivants.
3. Pincez une patte arrière et assurez-vous que l’animal ne réagit pas du tout avant de continuer.
4. Perfuser l’animal par voie transcardique avec 10 à 30 mL de tampon de perfusion glacé à l’aide d’une aiguille de 271/2 G jusqu’à ce que le tampon soit clair.
   note: Le volume du tampon de perfusion variera en fonction de la taille et de l’âge de l’animal.
5. Immédiatement après la perfusion, retirez la tête de l’animal. En venant de la moelle épinière, coupez le condyle occipital de chaque côté avec des ciseaux de dissection, veillez à ne pas endommager le cerveau. Après avoir coupé chaque côté avec soin, coupez un côté le long de l’os pariétal et frontal vers l’os nasal. À l’aide d’une pince, tirez délicatement le haut du crâne, retirez rapidement le cerveau (ou les structures du SNC d’intérêt) et placez-le dans du DPBS⁺⁺ pré-refroidi sur de la glace.
6. Répétez l’opération pour tous les autres animaux.
   note: Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire dans des conditions de stérilité appropriées.

3. Dissociation mécanique (Jour 1)

1. Une fois que tous les cerveaux ont été recueillis, coupez un cerveau en morceaux de^{1 mm 3} dans une boîte de Pétri sur de la glace avec une lame de scalpel froide, puis transférez-le dans un homogénéisateur de dénonciation glacé avec 5 à 7 ml de tampon de forage glacé. Dissociez un cerveau à la fois.
2. Dissociez le tissu en utilisant 10 à 20 mouvements doux et incomplets avec un homogénéisateur de dés lâche. Veillez à ne pas écraser directement le tissu au bas de l’homogénéisateur, mais plutôt à pousser le tissu à travers l’espace entre les côtés du piston et de l’homogénéisateur.
3. Retirez soigneusement le piston pour éviter l’introduction de bulles d’air. Laissez les morceaux de tissu mal dissociés se déposer au fond de l’homogénéisateur et transférez le surnageant dans un nouveau tube conique réfrigéré de 50 ml.
4. Remplacez le volume retiré par un tampon de dounage frais et répétez les étapes 3.2 et 3.3 pour un total de 3 à 4 tours, ou jusqu’à ce que tous les tissus aient été dissociés. Répétez la procédure pour chaque cerveau.

4. Élimination de la myéline (Jour 1)

REMARQUE : L’élimination de la myéline est utilisée pour isoler la microglie chez les animaux âgés de plus de P12.

1. Mesurez le volume de la suspension cellulaire dans le tube conique de 50 ml à l’aide d’une pipette de 25 ml, puis ajoutez un tampon de douncing glacé pour ajuster le volume total à 33,5 ml.
2. Ajoutez 10 ml de tampon de séparation de la myéline (MSB) à la suspension cellulaire et mélangez soigneusement en retournant le tube plusieurs fois. Cela se traduira par une concentration finale de 23 % de MSB dans un volume de 43,5 mL.
3. Cellules de centrifugation pendant 15 min à 500 x g à 4 °C avec freinage lent.
   note: La centrifugeuse devrait prendre environ 1,5 à 2 minutes pour décélérer. Cela générera une couche supérieure de myéline et de débris de cellules mortes, un surnageant quelque peu trouble et une pastille plus petite enrichie en cellules vivantes.
4. Retirez la couche supérieure de myéline/débris et le surnageant à l’aide d’une pipette. Lorsque vous retirez la couche supérieure, veillez à ce qu’elle soit enlevée autant que possible.
5. Remettre la pastille en suspension dans 12 mL de tampon de batée. Triturez doucement la suspension cellulaire pour briser les amas de cellules qui pourraient rester.

5. Immunopanoramique (Jour 1)

1. Faites passer la suspension cellulaire dans une crépine cellulaire de 70 μm pour éliminer les gros débris ou les amas cellulaires.
2. Rincez trois fois le plat de cuisson revêtu d’OX42 avec du DPBS++. Ne laissez pas la plaque sécher complètement entre les lavages.
3. Videz le dernier lavage DPBS++ et appliquez la suspension de cellules filtrées sur le plat de cuisson. Faites tourner doucement la plaque pour répartir les cellules, puis incubez la plaque sur une surface plane à température ambiante pendant 20 min pour permettre aux cellules d’adhérer. N’incubez pas plus de 20 minutes ou les cellules deviendront très difficiles à récupérer de la boîte.
4. Rincez 10 fois la coupelle de casserole avec du DPBS++ pour éliminer les cellules non adhérentes. La microglie sera fermement attachée à la plaque, alors faites tourner la plaque à chaque rinçage pour assurer l’élimination des autres cellules non adhérentes.
5. Videz le dernier lavage DPBS⁺⁺ et remplacez-le par 15 mL de DPBS++ et 200 μL de trypsine (solution mère à 1,25 %).
6. Incuber la parabole pendant ≤10 min à 37 °C avec 10 % de CO₂ pour trypsiniser.
   note: Ne continuez pas plus de 10 minutes ou la microglie deviendra difficile à enlever.
7. Après 10 min de trypsinisation, la microglie sera toujours collée à la plaque. Videz la trypsine/DPBS⁺⁺ et lavez-la délicatement 2 fois avec du ^DPBS++ pour éliminer la trypsine, remplacez-la par 12 ml de milieu de croissance microgliale (MGM) glacé.
8. Placez le plat sur de la glace pendant 2 minutes pour aider à affaiblir l’interaction cellule/substrat, et assurez-vous que le plat est plat pour éviter que certaines zones du plat ne se dessèchent.
9. Pipeter vigoureusement à l’aide d’une pipette de 10 ml et d’un contrôleur de pipette à grande vitesse pour récupérer les cellules de la boîte de cuisson. Dessinez une grille de 16 x 16 avec le jet de liquide de la pipette pour essayer de retirer toutes les cellules.
10. Vérifiez les cellules au microscope à un grossissement de 20X pour vous assurer qu’elles se sont détachées de la plaque. Marquez les endroits sur le dessus de la parabole où les cellules sont encore coincées et répétez le pipetage dans ces zones.
11. Prélever une suspension cellulaire et aliquote 3 à 4 mL de surnageant par tube conique de 15 mL. Tourner pendant 15 min à 500 x g à 4 °C avec freinage lent.
    note: La rotation de la microglie à travers un petit volume permet une récupération maximale des cellules.
12. Aspirez le surnageant, en laissant 0,5 mL de MGM avec la pastille cellulaire.
13. Remettez en suspension chaque pastille dans le MGM restant et regroupez les cellules de tous les tubes.
14. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
15. Cellules de plaque comme décrit aux étapes 6 et 7 en fonction de l’application.
16. Cellules de culture à 37 °C avec 10 % de CO₂.
    note: Les cellules peuvent être cultivées jusqu’à 3 à 4 semaines avec des changements réguliers de milieu ou une semaine sans changement de milieu.

6. Revêtement ponctuel des plaques/lamelles de culture tissulaire (Jour 1)

1. Plaquez 15 μL d’enrobage de collagène IV directement au centre d’une plaque de culture tissulaire à revêtement anionique/cationique de 24 puits (voir le tableau des matériaux pour plus de détails) et incubez pendant 15 min à 37 °C avec 10 % de CO₂.
2. Après avoir compté les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, diluez les cellules à 2,3 x 10⁵/mL dans MGM. Aspirer le point IV de collagène et déposer immédiatement 15 μL de suspension cellulaire à cet endroit ; Cela donnera 3,5 x 10³ cellules/spot. Incuber pendant 5 à 10 minutes à 37 °C avec 10 % de CO₂ pour permettre aux cellules d’adhérer, ajouter doucement 500 μL de milieu de croissance contenant du TGF-β2/IL-34/cholestérol équilibré en CO₂ (TIC) dans le puits.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tampon de retransmission			Recette : 200 μL de DNaseI à 0,4 % dans 50 mL de DPBS++ Commentaires : À utiliser lorsqu’il est glacé
Tampon de panoramique			Recette : 2 mg/mL de peptone provenant de solides de lait dans DPBS++
Milieu de croissance de la microglie (MGM)			Recette : DMEM/F12 contenant 100 unités/ml de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 2 mM de glutamine, 5 μg/mL de N-acétylcystéine, 5 μg/mL d’insuline, 100 μg/mL d’apo-transferrine et 100 ng/mL de sélénite de sodium Commentaires : Utilisez du MGM glacé pour retirer la microglie du plat d’immnopanning.
Revêtement de collagène IV			Recette : MGM contenant 2 μg/mL de collagène IV
Tampon de séparation de la myéline			Recette : 9 mL de Percoll PLUS, 1 mL de PBS 10x sans Ca++ et Mg++, 9 μL 1 M de CaCl2, 5 μL 1 M de MgCl2 Commentaires : Bien mélanger après l’ajout de CaCl2 et MgCl2
trypsine	sigma	Réf. T9935
DMEM/F12	Gibco	Référence 21041-02
Pénicilline/ Streptomycine	Gibco	Référence 15140-122
DMEM (glycémie élevée)	Gibco	Référence 11960-044
Collagène IV			Reconstitution : 200 μg/mL en PBS Concentration utilisée : 1:100 Stockage : -80°C
souris anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	MCA275R	Panoramique : 1:1 000 ; Coloration : 1:500
TGF-b2/IL-34/Milieu de croissance contenant du cholestérol (TIC)			Recette : MGM contenant 2 ng/mL de TGF-b2 humain, 100 ng/mL d’IL-34 murin, 1,5 μg/mL de cholestérol de laine ovine, 10 μg/mL d’héparane sulfate, 0,1 μg/ml d’acide oléique et 0,001 μg/ml d’acide gondoïque Remarques : Assurez-vous d’ajouter du cholestérol dans un milieu chauffé à 37 °C et n’ajoutez pas plus de 1,5 μg/mL ou il précipitera. Ne filtrez pas les milieux contenant du cholestérol. Équilibrez les milieux TIC avec 10 % de CO2 pendant 30 minutes à 1 heure avant de les ajouter aux cellules pour assurer un pH optimal.
Percoll PLUS	GE Soins de santé	Réf. # 17-5445-02
Assiettes Primaria	VWR	N° de catalogue # 62406-456
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS