1. Dissection et tranchage du cerveau
- Décapitez l’animal. Utilisez un scalpel pour ouvrir la peau de la tête et exposer la calotte crânienne.
- Utilisez des ciseaux fins pour couper la peau de la calotte crânienne et faites de petites incisions latérales de chaque côté à la base caudale/ventrale du crâne. Faites des coupes peu profondes supplémentaires en commençant par la face caudale/dorsale du crâne, en vous déplaçant dans la direction rostrale jusqu’à la ligne médiane dorsale en prenant soin de ne pas endommager le cerveau sous-jacent. Faites une coupe finale en « T » perpendiculaire à la ligne médiane au niveau des bulbes olfactifs.
note: Des précautions doivent être prises pour s’assurer qu’aucun dommage n’est causé à la ou aux régions cérébrales d’intérêt. En particulier, à aucun moment il ne doit y avoir de force de compression appliquée au cerveau lui-même.
- À l’aide de la pince à bout rond, saisissez le crâne, en commençant par la face rostrale-médiale et en remontant vers la direction caudale-latérale. Répétez l’opération pour que les deux côtés s’ouvrent et retirez les moitiés dorsales de la calotte crânienne pour exposer le cerveau. Prélevez doucement le cerveau intact dans le bécher de NMDG-HEPES aCSF pré-refroidi. Laissez le cerveau refroidir uniformément pendant ~1 min.
- À l’aide de la grande spatule, soulevez la cervelle du bécher et placez-la sur la boîte de Pétri recouverte de papier filtre. Coupez et bloquez le cerveau en fonction de l’angle de tranchage préféré et de la région cérébrale d’intérêt souhaitée. Travaillez rapidement pour éviter une privation prolongée d’oxygène lors de la manipulation.
note: De nombreux angles de tranchage sont possibles. La méthode de blocage exacte et l’angle de tranchage dépendront de la région cérébrale exacte, du type de cellule et du circuit à étudier.
- Fixez le bloc cérébral sur le porte-échantillon à l’aide d’une colle adhésive. Rétractez suffisamment la pièce intérieure du porte-échantillon pour retirer complètement le bloc cérébral à l’intérieur. Versez l’agarose fondue directement dans le support jusqu’à ce que le bloc cérébral soit entièrement recouvert d’agarose. Fixez le bloc de refroidissement d’accessoires prérefroidi autour du porte-échantillon pendant ~10 s jusqu’à ce que l’agarose se solidifie.
- Insérez le porte-échantillon dans le réceptacle de la trancheuse et vérifiez le bon alignement. Remplissez le réservoir avec le reste du NMDG-HEPES aCSF pré-refroidi et oxygéné du bécher de 250 mL et déplacez une pierre à bulles dans le réservoir pendant la durée du tranchage pour assurer une oxygénation adéquate.
- Ajustez le micromètre pour commencer à faire avancer l’échantillon de cerveau incrusté d’agarose. Démarrez le slicer et ajustez empiriquement la vitesse d’avancement et la fréquence d’oscillation au niveau souhaité.
note: Les deux paramètres doivent être dans la plage basse. Pour de meilleurs résultats, un seul passage du bras de la lame devrait prendre environ 20 s et l’oscillation devrait produire un bourdonnement très doux et doux, sans bourdonnement manifeste.
- Continuez à avancer et à trancher le tissu par incréments de 300 μm (ou autre épaisseur préférée) jusqu’à ce que la région cérébrale d’intérêt soit complètement sectionnée ; le temps total de la procédure de tranchage doit être inférieur à 15 min.
2. Procédure de récupération de protection NMDG optimisée
- Étape initiale de récupération des NMDG (étape critique) : À la fin de la procédure de sectionnement, prélever toutes les tranches à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique coupée et les transférer dans une chambre de récupération initiale préchauffée (34 °C) remplie de 150 mL de NMDG-HEPES aCSF. Transférez toutes les tranches en succession courte et démarrez une minuterie dès que toutes les tranches sont déplacées dans la chambre de récupération.
