Préparation de coupes cérébrales à l’aide d’une méthode de récupération protectrice basée sur le NMDG

Dans cet article

Résumé

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Source : Ting, J. T. et al. Préparation de tranches cérébrales aiguës à l’aide d’une méthode de récupération protectrice optimisée de la N-méthyl-D-glucamine. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo décrit un protocole permettant d’obtenir des tranches de cerveau à l’aide d’une méthode de récupération protectrice basée sur la N-méthyl-D-glucamine (NMDG). Un cerveau disséqué est incubé dans un aCSF avec NMDG et HEPES pour minimiser la mort et les dommages aux cellules neuronales pendant la section. La section est autorisée à récupérer dans l’aCSF pour restaurer les activités cellulaires

Protocole

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1. Dissection et tranchage du cerveau

Décapitez l’animal. Utilisez un scalpel pour ouvrir la peau de la tête et exposer la calotte crânienne.
Utilisez des ciseaux fins pour couper la peau de la calotte crânienne et faites de petites incisions latérales de chaque côté à la base caudale/ventrale du crâne. Faites des coupes peu profondes supplémentaires en commençant par la face caudale/dorsale du crâne, en vous déplaçant dans la direction rostrale jusqu’à la ligne médiane dorsale en prenant soin de ne pas endommager le cerveau sous-jacent. Faites une coupe finale en « T » perpendiculaire à la ligne médiane au niveau des bulbes olfactifs.
note: Des précautions doivent être prises pour s’assurer qu’aucun dommage n’est causé à la ou aux régions cérébrales d’intérêt. En particulier, à aucun moment il ne doit y avoir de force de compression appliquée au cerveau lui-même.
À l’aide de la pince à bout rond, saisissez le crâne, en commençant par la face rostrale-médiale et en remontant vers la direction caudale-latérale. Répétez l’opération pour que les deux côtés s’ouvrent et retirez les moitiés dorsales de la calotte crânienne pour exposer le cerveau. Prélevez doucement le cerveau intact dans le bécher de NMDG-HEPES aCSF pré-refroidi. Laissez le cerveau refroidir uniformément pendant ~1 min.
À l’aide de la grande spatule, soulevez la cervelle du bécher et placez-la sur la boîte de Pétri recouverte de papier filtre. Coupez et bloquez le cerveau en fonction de l’angle de tranchage préféré et de la région cérébrale d’intérêt souhaitée. Travaillez rapidement pour éviter une privation prolongée d’oxygène lors de la manipulation.
note: De nombreux angles de tranchage sont possibles. La méthode de blocage exacte et l’angle de tranchage dépendront de la région cérébrale exacte, du type de cellule et du circuit à étudier.
Fixez le bloc cérébral sur le porte-échantillon à l’aide d’une colle adhésive. Rétractez suffisamment la pièce intérieure du porte-échantillon pour retirer complètement le bloc cérébral à l’intérieur. Versez l’agarose fondue directement dans le support jusqu’à ce que le bloc cérébral soit entièrement recouvert d’agarose. Fixez le bloc de refroidissement d’accessoires prérefroidi autour du porte-échantillon pendant ~10 s jusqu’à ce que l’agarose se solidifie.
Insérez le porte-échantillon dans le réceptacle de la trancheuse et vérifiez le bon alignement. Remplissez le réservoir avec le reste du NMDG-HEPES aCSF pré-refroidi et oxygéné du bécher de 250 mL et déplacez une pierre à bulles dans le réservoir pendant la durée du tranchage pour assurer une oxygénation adéquate.
Ajustez le micromètre pour commencer à faire avancer l’échantillon de cerveau incrusté d’agarose. Démarrez le slicer et ajustez empiriquement la vitesse d’avancement et la fréquence d’oscillation au niveau souhaité.
note: Les deux paramètres doivent être dans la plage basse. Pour de meilleurs résultats, un seul passage du bras de la lame devrait prendre environ 20 s et l’oscillation devrait produire un bourdonnement très doux et doux, sans bourdonnement manifeste.
Continuez à avancer et à trancher le tissu par incréments de 300 μm (ou autre épaisseur préférée) jusqu’à ce que la région cérébrale d’intérêt soit complètement sectionnée ; le temps total de la procédure de tranchage doit être inférieur à 15 min.

2. Procédure de récupération de protection NMDG optimisée

Étape initiale de récupération des NMDG (étape critique) : À la fin de la procédure de sectionnement, prélever toutes les tranches à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique coupée et les transférer dans une chambre de récupération initiale préchauffée (34 °C) remplie de 150 mL de NMDG-HEPES aCSF. Transférez toutes les tranches en succession courte et démarrez une minuterie dès que toutes les tranches sont déplacées dans la chambre de récupération.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom

Entreprise

Numéro de catalogue

Commentaires

Compresstome VF-200

Instruments de précision

VF-200

Trancheuse à tissu vibrant (recommandée)

N-méthyl-D-glucamine

Sigma Aldrich

M2004

Constituant du LCR

chlorure de sodium

Sigma Aldrich

S3014

Constituant du LCR

chlorure de potassium

Sigma Aldrich

Réf. P5405

Constituant du LCR

Phosphate de sodium monobasique dihydraté

Sigma Aldrich

Référence 71505

Constituant du LCR

Bicarbonate de sodium

Sigma Aldrich

S5761

Constituant du LCR

HEPES

Sigma Aldrich

N° H4034

Constituant du LCR

glucose

Sigma Aldrich

Réf. G7021

Constituant du LCR

Ascorbate de sodium

Sigma Aldrich

A4034

Constituant du LCR

thiourée

Sigma Aldrich

Réf. T8656

Constituant du LCR

Pyruvate de sodium

Sigma Aldrich

P5280

Constituant du LCR

Chlorure de calcium dihydraté

Sigma Aldrich

Réf. C7902

Constituant du LCR

Sulfate de magnésium heptahydraté

Sigma Aldrich

M1880

Constituant du LCR

Pince émoussée incurvée

Outils scientifiques fins

Référence 11065-07