Technique d’incubation prolongée du tissu neuronal de la rétine

Résumé

Source : Cameron, M. A., et al. Incubation prolongée de tissu neuronal aigu pour l’électrophysiologie et l’imagerie calcique. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo montre une méthode d’incubation prolongée du tissu neuronal de la rétine. Les œilletons contenant de la rétine sont obtenus à partir d’un œil de souris ; la membrane limitante interne (MLI) est digérée par voie enzymatique pour exposer les cellules neuronales de la rétine, et l’œilleton traité ou la rétine isolée est transféré dans un incubateur spécialisé pour une incubation prolongée à basse température.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Préparation rétinienne Wholemount et élimination de la membrane limitante interne

1. Préparez des montages rétiniens dans des conditions d’éclairage normales ou sous une lumière rouge/infrarouge tamisée.
2. Euthanasier l’animal par luxation cervicale et énucléation immédiate des yeux. Faites une petite incision le long de l’ora serrata et placez-la dans un milieu Ames ou dans du liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) contenant (mM) : 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 3 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 glucose, 0,5 L-glutamine, et saturez avec du carbogen (mélange 95 % O₂/5 % CO₂ ; ~300 mOsm ; pH 7,4), à température ambiante (RT).
3. Retirez immédiatement la cornée, le cristallin et le vitré en coupant le long de l’ora serrata avec de petits ciseaux et en retirant le cristallin et le vitré avec une pince. Placer les tissus dans le système d’incubation à RT.
   note: Le tissu rétinien peut être maintenu dans l’œilleton, après une réduction lente de la température à 15 - 16 °C, pendant >24 h dans le système d’incubation jusqu’à ce que nécessaire.
4. Pour retirer l'ILM, transférez l'œilleton contenant la rétine dans un petit bocal en verre contenant 30 U/mL de papaïne, 1 mM de L-cystine, 0,5 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et 0,005 % de désoxyribonucléase (DNase) dans une solution saline équilibrée (BSS) d'Earl's à 37 °C pendant 20 min. Appliquez 95 % O₂/5 % CO₂ sur la solution à travers le couvercle, mais ne faites pas de bulles. Si vous utilisez des tissus de jeunes animaux (<6 semaines), diluez la solution à mi-concentration.
   1. Arrêtez la digestion enzymatique en plaçant le tissu dans une solution d'ovomucoïde (10 mg/mL) et d'albumine sérique bovine (BSA, 10 mg/mL) pendant 10 min dans Earl's BSS. Lavez soigneusement les tissus avec un LCR avant de les transférer dans le système d’incubation et réduisez la température à 15 - 16 °C.
5. Maintenez le tissu rétinien dans l’œilleton jusqu’à ce que nécessaire. Pour le transfert au microscope, isolez la rétine de l’œilleton et coupez-la en 4 morceaux avec une lame de rasoir. Si toute la rétine est nécessaire, faites quatre petites incisions à la périphérie de la rétine pour lui permettre de rester à plat.
   note: Pour les expériences d’imagerie, chargez avec des colorants calciques avant le transfert dans le système d’incubation, voir ci-dessous.

2. Maintenir les tissus dans l’incubateur

1. Placez le tissu dans la chambre principale contenant les sondes pour les mesures de pH et de température (Figure 1A, B).
2. Faire circuler le LCR à travers une deuxième chambre (chambre UVC, construite comme décrit précédemment) isolée de la chambre principale et exposée à une lumière ultraviolette C (UVC) de 1,1 W (254 nm, lampe UV du stérilisateur 5W/2P) afin d’éradiquer les bactéries flottant dans la solution (Figure 1A). Contrôlez la synchronisation de la lumière UVC à l’aide d’une minuterie programmable à l’aide d’une fonction aléatoire qui s’allume à des moments variant entre 15 et 26 minutes toutes les 15 à 30 minutes pour éviter un échauffement excessif de l’aCSF.
3. Réglez le débit dans la chambre UVC à 12 mL/min comme indiqué précédemment. Couvrez la chambre UVC avec une feuille d’aluminium pour éviter l’éclairage UVC à l’extérieur de la chambre, ce qui peut endommager les tissus neuronaux.
   note: Pour un tissu rétinien adapté à l’obscurité, appliquez un couvercle sur mesure sur la chambre principale pour exclure la lumière.
4. Utilisez une pompe péristaltique pour faire circuler la solution (aCSF) à travers les deux chambres et un refroidisseur à plaque froide thermoélectrique Peltier pour refroidir ou chauffer la chambre principale aux températures souhaitées dans la plage de 0 à 50 °C. Pour une incubation optimale des tissus, utilisez 15 à 16 °C pour une viabilité à long terme.

Résultats

Graphique 1. Un système d’incubation qui permet une régulation stricte de l’environnement tissulaire. A, Schéma du système d’incubation composé d’une plaque Peltier de refroidissement, d’une chambre principale, d’une pompe péristaltique et d’une chambre UVC. B, Vue latérale de la chambre principale montrant les points d’entrée et de sortie de l’aCSF, ainsi que les sondes d’ent...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
chlorure de sodium	Sigma Aldrich VETEC	V800372
chlorure de potassium	Sigma Aldrich	P9333
N-méthyl-D-glucamine	Sigma Aldrich	M2004
D-glucose	Sigma Aldrich	Référence G5767
Bicarbonate de sodium	Sigma Aldrich	S6014
chlorure de magnésium	Sigma Aldrich	Référence M9272
Chlorure de calcium	Sigma Aldrich	223506
Système de dissociation de la papaïne	Worthington	LK003150
Microscope droit à platine fixe	Olympe	BX51WI
Objectif du microscope	Olympe	XLUMPlanFLN 20x/1.00w	20 fois
Objectif du microscope	Olympe	LUMPlanFLN 60x/1.00w	60 fois
Braincubator	Payo Scientific	BR26021976	www.braincubator.com.au
Refroidisseur à plaque froide thermoélectrique Peltier	Technologie TE	CP-121
Régulateur de température	Technologie TE	TC-36-25 RS232