1. Préparation du matériel et du milieu de culture
- Pour la dissection et la dissociation de la SCZ (zone sous-calleuse), enveloppez la matrice cérébrale, la lame de rasoir à double tranchant et la pince avec du papier d’aluminium, puis stérilisez-les à l’autoclave.
- Préparez 50 ml de tampon PBS (solution saline tamponnée au phosphate) froid pour laver tout le cerveau de la souris.
- Installez un microscope de dissection et préparez les outils chirurgicaux nécessaires à la dissection du cerveau (ciseaux autoclaves et pinces) et à l’isolement de la SCZ (seringue de 1 ml, aiguille 30 G, matrice cérébrale et pince fine).
- Préparation du milieu N2 :
- Préparez un milieu F-12/DMEM (+L-glutamine, + bicarbonate de sodium) avec 2 % de suppléments de B27, 1 % de N2 et 1 % de pénicilline-streptomycine.
Remarque : Le milieu de croissance est constitué d’un milieu N2 et de facteurs de croissance (20 ng/mL de facteur de croissance épidermique purifié (EGF) et 20 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF2)).
- Préparez un tampon de digestion (40 unités/ml de papaïne, 2,4 unités/ml de dispase II et 2 % de pénicilline-streptomycine dans du PBS) pour la digestion tissulaire.
- Préparation de la plaque de revêtement et de la lamelle :
- Préparez de la poly-L-ornithine (PLO ; 0,01 %) et de la laminine (10 μg/ml dissoute dans DH2O). Pour revêtir des plaques à 6 puits pour le maintien des SCZ-aNSC (cellules souches neurales adultes) en monocouche ou des lamelles de 18 mm pour l’immunomarquage, incubez-les avec du PLO pendant la nuit à 4°C. Ensuite, lavez-les 3 fois avec DH2O. Laissez sécher les plaques et les lamelles après le dernier lavage.
- Ensuite, incubez les plaques avec de la laminine pendant une nuit à 4 °C. Ensuite, lavez-les 3 fois avec DH2O.
Attention : Ne séchez pas la laminine, ce qui affecterait l’attachement des cellules.
Remarque : Les solutions de revêtement peuvent être réutilisées 3 fois.
2. Isolement et dissociation de la ZCD adulte
- Avant la préparation de la culture, placez la matrice cérébrale et le rasoir à double tranchant sur de la glace.
Remarque : Ne congelez pas la matrice cérébrale, car le cerveau pourrait s’y attacher.
- Sacrifier une souris (âgée de 8 semaines) par asphyxie au CO2 ou luxation cervicale.
- Coupez la tête avec des ciseaux tranchants après avoir pulvérisé de l’éthanol à 70 %. Pour immobiliser la tête, tenez fermement les deux côtés de la tête. Coupez la peau avec des ciseaux sur la ligne médiane dans une direction caudale-rostrale. Cela favorise l’élimination complète de la peau du crâne.
- Retirez d’abord la partie caudale du crâne (postérieure à lambda), puis insérez la pince entre le crâne et le cerveau en position médiane dorsale. Saisissez l’os pariétal gauche (ou droit) et retirez-le soigneusement. Répétez cette procédure pour l’ablation de l’autre os pariétal.
Remarque : La déconnexion du nerf optique et l’ablation des méninges du cerveau facilitent le détachement du cerveau du crâne.
- Transférez le cerveau dans un tampon PBS froid (25 ml) et rincez-le deux fois pour éliminer l’excès de sang.
- Placez le cerveau dans la matrice cérébrale sur de la glace et faites des coupes coronales pour obtenir des tranches de 1 mm d’épaisseur. Transférez les tranches de cerveau (1 mm) contenant les régions SCZ situées dans la partie postérieure du cerveau dans un PBS froid dans une boîte de Pétri en plastique de 35 mm.
prudence: Afin d’obtenir un plan parallèle de coupes coronales, assurez-vous que la fissure cérébrale est placée sur la ligne médiane de la matrice cérébrale ; Il est essentiel d’éviter les variations inutiles dans les sections.
note: Obtenir des coupes de cerveau à 2-3 mm en arrière de la bregma ; cela permet de séparer la SCZ de la SVZ (zone sous-ventriculaire).
- Sous le microscope de dissection avec un faible grossissement, micro-disséquez la SCZ de la zone de la substance blanche du cortex et de l’hippocampe avec une aiguille 30G pliée6,9. Ensuite, supprimez les régions du cortex au-dessus de la SCZ. Placez la région SCZ disséquée des tranches dans une boîte de Pétri en plastique de 35 mm sur de la glace sans PBS.
note: La contamination de régions supplémentaires contenant des neurones matures pourrait affecter la viabilité des aNSC et la formation de la neurosphère, car elles subissent la mort cellulaire dans des conditions de culture d’aNSC.
- À l’aide d’une aiguille pliée de 30 G, coupez immédiatement les tissus disséqués en petits morceaux.
note: Si vous avez besoin de plus de temps pour disséquer le tissu SCZ, immergez-le dans du PBS froid avant de le hacher.
- Remettez le tissu haché en suspension avec 1 ml de tampon de digestion, transférez le tissu dans un tube de 15 ml contenant 2 ml de tampon de digestion et incuberez-le pendant 30 min dans un bain-marie à 37°C.
note: Agitez le tube toutes les 10 min pour bien mélanger.
3. Culture de cellules souches neurales adultes dérivées de la zone sous-calleuse
- Tapotez légèrement le tube pour dissocier le tissu digéré, puis centrifugez le tube à 145 x g pendant 5 min. Jetez le surnageant, remettez le tissu digéré en suspension avec 1 mL de milieu N2 préchauffé pour éliminer le tampon de digestion, et pipetez doucement la solution de l’échantillon un maximum de 5 fois à l’aide d’une pipette P1000.
note: Une trituration excessive avec une pointe de pipette étroite peut diminuer la viabilité cellulaire et la croissance ultérieure.
- Centrifuger le tube à 145 x g pendant 5 min. Après avoir jeté le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 1 ml de milieu N2.
- Préparez 1 ml de milieu N2 dans une plaque non revêtue à 6 puits et ajoutez 1 ml des cellules en suspension pour obtenir un volume final de 2 ml.
- Ajouter EGF (20 ng/ml) et bFGF (20 ng/ml) dans chaque puits. Secouez doucement le plat de culture à 6 puits à la main pour mélanger les facteurs de croissance ajoutés avec les cellules plaquées. Conservez la plaque à 6 puits dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
- Ajoutez de l’EGF (20 ng/ml) et du bFGF (20 ng/ml) dans chaque puits tous les jours pendant 8 jours. Tous les trois jours, ajouter 200 μl de milieu N2 pour maintenir le volume approximatif de 2 ml du milieu.
4. Transmission des NSC en tant que neurosphères et aux cultures monocouches
- Rassemblez les neurosphères et transférez-les dans un nouveau tube conique de 15 ml.
Remarque : Le nombre de neurosphères (>50 μm de diamètre) par puits provenant de la SCZ d’un seul cerveau de souris était de 64,3 ± 7,31, ce qui était inférieur à celui de la SVZ (190,5 ± 6,33).
- Incuber les neurosphères avec 0,5 ml de tampon de dissociation pendant 5 min dans un bain d’eau à 37°C pour dissocier les neurosphères en cellules uniques. Les neurosphères primaires peuvent être dissociées en cellules uniques et maintenues sur plusieurs passages sous forme de neurosphères ou de cultures monocouches.
note: L’expansion des SCZ-aNSC en tant que monocouche est supérieure à celle des neurosphères, car les SCZ-aNSC peuvent être passées >10 fois dans un format de culture monocouche, mais <5 fois dans un format de culture de neurosphère.
prudence: Les SCZ-aNSC présentent une forte agrégation, et il est difficile de les dissocier en cellules uniques. Ainsi, le format de culture de la neurosphère n’est pas recommandé pour l’expansion cellulaire de routine.
- Pipeter doucement la solution d’échantillon de haut en bas avec une pipette P1000 moins de 5 fois et centrifuger le tube à 145 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre les neurosphères en suspension avec 1 ml de milieu N2.
note: Une surtitration avec une pointe de pipette étroite peut diminuer la viabilité cellulaire et la croissance ultérieure.
- Pour compter les cellules, faites un mélange 1:1 de la suspension cellulaire (10 μl) et de la solution de bleu de trypan à 0,4 %, puis comptez le nombre de cellules vivantes sur un hématocytomètre. Après avoir recouvert une plaque à 6 puits de PLO/laminine, plaquez les cellules à 2,5 x 105 cellules/ml avec 2 ml de milieu N2 pour chaque puits.
note: Les changements dans la densité cellulaire peuvent affecter leur état et leur potentiel de différenciation.
- Maintenez les SCZ-aNSC avec un traitement quotidien des facteurs de croissance (2 ml, 20 ng/ml) pendant 5 jours, puis passez-les.
5. Différenciation des cellules souches neurales adultes dérivées de la zone sous-calleuse
- Déposer les aNSC sur une lamelle de 18 mm recouverte de PLO/laminin avec 1 x 105 cellules/ml dans 1 ml de N2 avec des facteurs de croissance (20 ng/ml) pour la différenciation des SCZ-aNSC.
- Le lendemain, lorsque les cellules sont fermement fixées à la lamelle, remplacez le milieu de croissance par du N2 pour éliminer les facteurs de croissance.
- Après 6 jours, lavez les cellules différenciées avec 1 ml de PBS pour éliminer les débris cellulaires et les fixer pour l’immunomarquage.
Remarque : BrdU peut être incorporé dans l’ADN nouvellement synthétisé des cellules proliférantes. Par conséquent, si vous le souhaitez, le BrdU (10 μg/ml) peut être ajouté aux cellules vivantes avant la fixation des cellules.
