1. Culture et stockage de cellules endothéliales périventriculaires humaines
- Maintenir les cellules endothéliales périventriculaires humaines sur des plaques à 6 puits recouvertes d’une matrice de membrane basale (voir le tableau des matériaux) dans un milieu de cellules endothéliales périventriculaires (milieu E6 contenant 50 ng/mL de facteur de croissance de l’endothélium vasculaire A [VEGF-A], 100 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes 2 [FGF2] et 5 μM d’acide gamma-aminobutyrique [GABA]) à 37 °C et 5 % de CO2. Changez de support tous les deux jours.
- Décongelez la matrice de la membrane basale à 4 °C et préparez une solution 1:100 en la diluant dans du milieu froid Eagle modifié de Dulbecco et un mélange de nutriments F-12 (DMEM/F12). Enduire chaque puits d’une plaque à 6 puits avec 1 mL de solution matricielle. Incuber les plaques à 37 °C pendant au moins 1 h avant utilisation.
- Permettre aux cellules endothéliales périventriculaires humaines d’atteindre une confluence de 80 % à 90 %. Aspirer le milieu du puits. Lavez les puits une fois avec 1 mL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) par puits.
- Détachez les cellules en ajoutant 1 mL de solution de dissociation cellulaire (voir le tableau des matériaux) par puits. Incuber à 37 °C pendant 5 min. Après 5 min, ajoutez 1 mL de milieu de cellules endothéliales périventriculaires. Transvaser la solution cellulaire dans un tube conique de 15 mL.
note: Nous utilisons ici l’Accutase pour la dissociation cellulaire, par opposition à la TrypLE dans les sections 3 et 4.
- Centrifugez les cellules à 500 x g pendant 5 min à température ambiante, aspirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu cellulaire endothélial périventriculaire.
- Comptez les cellules vivantes à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu trypan. Cellules de semence en plaques fraîches enrobées de matrice à une densité de 1,2 x 105 cellules/cm2. Incuber à 37 °C et 5 % CO2.
- Stocker les cellules endothéliales périventriculaires humaines par cryoconservation dans un milieu de congélation (90 % de milieu de cellules endothéliales périventriculaires et 10 % de diméthylsulfoxyde [DMSO]).
- Dissociez et collectez les cellules en suivant les étapes 1.3 et 1.4 ci-dessus. Comptez les cellules dans la solution par la méthode d’exclusion du bleu de trypan.
- Cellules de centrifugation à 500 x g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire à 5 x 106 cellules/mL de milieu de congélation.
- Distribuer 1 mL de milieu de congélation plus des cellules par cryoflacon. Placez les flacons dans une chambre remplie d’isopropanol et laissez refroidir une nuit à -80 °C à 1 °C/min. Transférez les flacons dans un réservoir d’azote liquide le lendemain pour un stockage à long terme.
2. Préparation des cellules endothéliales périventriculaires humaines pour le dosage
- Permettre aux cellules endothéliales périventriculaires humaines d’atteindre une confluence de 70 à 80 %.
- Dissociez les cellules en suivant les étapes 1.3 à 1.5 décrites ci-dessus. Comptez les cellules à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu trypan.
3. Préparation des interneurones GABAergiques humains pour le dosage
REMARQUE : Les interneurones GABAergiques dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC) et le milieu neuronal ont été achetés dans le commerce (voir Tableau des matériaux). Les neurones sont générés en différenciant une lignée iPSC dérivée de fibroblastes humains selon un protocole développé par le fabricant. Les cellules ont été décongelées et cultivées selon le protocole du fabricant.
- Décongelez les interneurones GABAergiques humains et cultivez-les dans une plaque à 12 puits pendant deux semaines jusqu’à une confluence de 70 % à 80 %.
- Le jour du dosage, une solution chaude de dissociation cellulaire (voir tableau des matières) et une aliquote de milieu neuronal à 37 °C pendant 10 min avant utilisation.
- Aspirez le milieu de chaque puits contenant les cellules. Laver les cellules avec 1 mL de PBS stérile par puits.
- Détacher les cellules en ajoutant 0,5 mL de solution de dissociation préchauffée par puits et incuber à 37 °C pendant 5 min. Ajouter 1 mL de milieu neuronal par puits. Transférer la solution cellulaire dans un tube conique de 15 ml. Triturer doucement pour dissocier les amas cellulaires.
- Centrifugez les cellules à 380 x g pendant 5 min à température ambiante, aspirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu neuronal. Comptez les cellules vivantes à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu trypan.
4. Préparation des cellules endothéliales humaines témoins pour le dosage
REMARQUE : Des cellules endothéliales humaines témoins dérivées d’iPSC et un milieu cellulaire endothélial ont été achetés dans le commerce (Tableau des matériaux). Ces cellules endothéliales sont générées par la différenciation d’une lignée iPSC dérivée de fibroblastes humains jusqu’au devenir endothélial selon un protocole développé par le fabricant. Les cellules ont été décongelées et cultivées sur un substrat de fibronectine selon le protocole du fabricant. Des plaques recouvertes de fibronectine ont été préparées selon le protocole du fabricant.
- Décongeler les cellules endothéliales humaines et les cultiver dans des plaques à 6 puits jusqu’à une confluence de 80 % à 90 %.
- Le jour du dosage, une solution chaude de dissociation cellulaire (voir tableau des matériaux) et une aliquote de milieu endothélial à 37 °C pendant 10 min avant l’utilisation.
- Aspirez le milieu de chaque puits contenant les cellules. Laver les cellules avec 1 mL de PBS stérile par puits.
- Détachez les cellules en ajoutant 0,5 mL de solution de dissociation préchauffée par puits. Incuber à température ambiante pendant 5 min. Ajouter 1 mL de milieu cellulaire endothélial par puits pour neutraliser la solution de dissociation. Transférer la solution cellulaire dans un tube conique de 15 ml.
- Cellules de centrifugation à 200 x g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu cellulaire endothélial. Comptez les cellules vivantes à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu trypan.
5. Préparation des inserts de culture à un puits
- Décongeler 1 mg/mL de solution de laminine à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C.
- Enduire un nombre approprié de boîtes de 35 mm d’une solution de poly-L-ornithine à 0,01 % (1 mL par boîte). Incuber les plats à température ambiante pendant au moins 1 h.
- Diluer 1 mg/mL de solution de laminine 1:300 dans de l’eau stérile jusqu’à une concentration finale de 3,3 μg/mL immédiatement avant l’utilisation.
- Aspirez complètement la poly-L-ornithine de chaque plat. Rincez abondamment chaque plat 3 fois avec de l’eau stérile et aspirez complètement pour éviter la toxicité cellulaire induite par la poly-L-ornithine.
- Ajouter 1 mL de solution de laminine de 3,3 μg/mL dans chaque plat et incuber à 37 °C pendant une nuit ou au moins 1 h. Retirer la solution de laminine du plat immédiatement avant utilisation.
note: Vous pouvez également conserver les boîtes contenant de la laminine à 4 °C. Équilibrez les boîtes dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C avant utilisation.
- Coupez trois côtés d’un puits d’un insert de culture en silicone à deux puits (Figure 1A) à l’aide d’une lame stérile pour générer un insert à un puits (Figure 1B).
note: Maintenez l’insert à deux puits fermement fixé à la surface de l’emballage d’origine pendant la coupe pour assurer une coupe lisse et protéger l’adhérence de l’insert.
- Aspirer la solution de laminine de la vaisselle.
note: Ne lavez pas la vaisselle avec du PBS stérile ou de l’eau après l’incubation de la laminine. Les surfaces humides empêcheront l’adhérence étanche de l’insert de culture.
- Retirez l’insert à un puits avec une pince à épiler stérile et placez-le au centre du plat recouvert de poly-L-ornithine/laminine. Appuyez le long des bords de l’insert pour le fixer à la surface du plat.
- Retournez délicatement le plat pour vérifier que l’insert adhère bien.
- Gardez le plat à l’envers et marquez le bord du compartiment d’insertion à l’aide d’un marqueur noir permanent avec une pointe ultra-fine (Figure 1C).
6. Essai de migration en co-culture
- Co-suspension de 3 x 104 interneurones GABAergiques et de 3 x 104 cellules endothéliales périventriculaires humaines dans 70 μL de milieu de co-culture (50 % de milieu d’entretien périventriculaire sans GABA et 50 % de milieu neuronal). Ensemencez cette solution cellulaire à l’intérieur du compartiment à un puits. Préparez un nombre approprié de ces plats de dosage.
note: Le GABA n’a pas été ajouté dans le milieu de co-culture pour exclure l’effet du GABA exogène sur la migration.
- Vérifiez au microscope que les cellules ne fuient pas du compartiment d’insertion.
- Ajouter lentement 1 ml de milieu de coculture sur le côté de la boîte pour éviter que l’enrobage ne sèche.
note: Ajouter lentement le long du bord du plat afin de ne pas déranger l’insert.
- Comme premier contrôle, ensemencez 3 x 104 interneurones GABAergiques humains uniquement dans 70 μL de milieu de co-culture par insert à un puits. Préparez un nombre approprié de ces plats.
- Comme deuxième contrôle, co-ensemencez 3 x 104 interneurones humains GABAergiques avec 3 x 104 cellules endothéliales humaines de contrôle dans 70 μL de milieu de co-culture par insert à un puits. Préparez un nombre approprié de plats.
- Incuber les plats pendant 24 h à 37 °C et 5 % de CO2. Après 24 h d’incubation, vérifiez au microscope que les cellules se sont bien fixées et qu’il n’y a pas de fuite.
- Après 48 h de semis, retirez délicatement l’insert à l’aide d’une pince à épiler stérile. Vérifiez au microscope que la couche cellulaire n’est pas perturbée (jour 0).
- Retirer le milieu et ajouter 1 mL de milieu de coculture frais.
note: Réservez un nombre approprié de plats pour l’acquisition des images du jour 0.
- Incuber les cellules pendant 5 jours à 37 °C et 5 % de CO2.
