Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Placage des tranches sur les inserts
- Remplissez chaque puits d’une plaque de 6 puits avec 1 200 μl de milieu de culture en tranches. Remplissez tous les puits inutilisés avec 1 200 μl de PBS et remplissez l’espace central de la plaque avec 5 ml de PBS 1x. Conservez cette plaque à 37 °C.
- À l’aide de l’outil cuillère à fentes, placez une tranche de cerveau dans le support de l’insert, en poussant doucement la tranche pour qu’elle soit complètement immergée. Répétez l’opération pour toutes les tranches.
- À l’aide d’un p1000, prélevez 1 ml de milieu de culture en tranches du haut de l’insert et distribuez-le dans le fond du puits. Retirez et jetez l’excédent de milieu jusqu’à ce que les bords de l’agarose autour de la tranche de cerveau deviennent visibles. Faites-le pour les tranches restantes.
- Saisissez l’insert par le rebord à l’aide d’une pince, inclinez-le et retirez l’excédent de support. Ensuite, transférez rapidement l’insert dans une boîtede 35 mm 2 contenant 1 ml de milieu de culture en tranches. Utilisez 2 paires de pinces pointues pour retirer l’agarose autour du tissu, en prenant soin de ne pas étirer/endommager, trancher ou percer un trou dans la membrane (le plus facile est de faire une déchirure au bord même de l’agarose, puis de séparer l’agarose de chaque côté). Ensuite, remettez l’insert dans la plaque à 6 puits et répétez l’opération pour les tranches restantes.
- Dans une hotte de culture tissulaire avec le ventilateur éteint (pour éviter que les tranches ne se dessèchent), retirez les fragments d’agarose de chaque membrane.
- Transférez les tranches dans la plaque à 6 puits préparée à l’étape 1.1 et conservez la plaque à 37 °C. Incuber les tranches pendant 24 à 48 heures.
2. Changement du milieu de culture en tranches
- Répétez l’étape 1.1 avec une assiette fraîche à 6 puits.
- Dans une hotte de culture tissulaire avec le ventilateur éteint, transférez les inserts sur de nouvelles plaques à 6 puits contenant des tranches fraîches.
3. Placage des cellules tumorales sur la tranche
- Soniquez le colorant Cm-DiI et faites-le tourner à vitesse moyenne pendant 2 min.
- Faites pivoter les cellules tumorales utilisées pour le recouvrement à 201 x g pendant 5 min. Remettre ensuite en suspension dans 2 ml de milieu de culture en tranches.
- Ajouter 7 μl de Cm-DiI dans les 2 ml de cellules et de milieux et incuber à 37 °C pendant 20 min.
- Faites tourner les cellules à 201 x g pendant 5 minutes et mettez-les en suspension dans 200 μl de milieu de tranchage. Triturez doucement pour dissocier les cellules (10 à 20 fois ou jusqu’à ce que la pastille ait disparu), puis ajoutez un milieu de tranchage de 800 μl pour obtenir un volume total de 1 000 μl.
- Comptez les cellules tumorales viables à l’aide du bleu Trypan. Ajoutez des microsphères fluorescentes vertes aux cellules tumorales à la même concentration que les cellules. Ces microsphères inertes serviront de contrôle. Faites tourner le mélange cellule/microsphère à 201 x g pendant 5 min et remettez-le en suspension dans la quantité souhaitée de milieu de culture en tranches. Cellules sur plaque à une densité de 6 000 cellules/tranche dans un volume de 65 μl. Le nombre de cellules plaquées par tranche peut être augmenté en fonction des préférences et de la disponibilité.
- Dans le capot de culture tissulaire, distribuez des cellules dans 65 μl de milieu/tranche au centre de la tranche.
